Anne stresi, fetal mast hücre programlaması yoluyla erken yaşam egzamasını tetikler

Fareler

Fareler, Centre Régional d'Exploration Fonctionnelle et de Ressources Expérimentales'in (CREFRE) yerel hayvan tesislerinde patojen içermeyen sıhhi koşullarda, su ve yiyeceğe serbest erişimle yetiştirildi ve barındırıldı ve 22 °C ortam sıcaklığında 12 saatlik aydınlık ve karanlık döngülerine tabi tutuldu. C57BL6j fareleri Janvier Labs veya Charles River laboratuvarlarından satın alındı. Mcpt5-cre⁶⁶iDTA, AdKOv2 ve Cdh5-creERT2;M_TM_G fareler A. Roers (Heidelberg Üniversite Hastanesi), J.-C. Sırasıyla Guéry, P. Val ve F. Lenfant. Atopik dermatit modellerinde laboratuvarımızda elde edilen sonuçlara dayanarak⁹klinik puanların ortalama değerlerindeki farka ve bireysel ölçümler için öngörülen 3,5 standart sapmaya dayanarak, klinik puandaki istatistiksel anlamlılık düzeyindeki bir farkı saptamak için bize %90 güç verecek grup başına altı fareye ihtiyacımız olduğunu tahmin ediyoruz *Pİki kuyruklu eşleştirilmemiş kullanarak ≤ 0,05 T-test. Davranış testleri için örnek boyutları, önceki yayınlarla tutarlı olarak eşit sayıda erkek ve dişi hayvan ve eşit grup boyutunu sağlayacak şekilde seçilmiştir.⁶⁷. İn vitro kültür deneyleri (DRG nöron kültürleri ve mast hücre aktivasyon analizleri) için numune boyutları da deney koşulu başına eşit sayıda kopya sağlayacak şekilde seçildi. Biyolojik kopyaların sayısı, benzer yöntemlerin kullanıldığı önceki yayınlara dayanıyordu.^9,23Biyolojik değişkenliği hesaba katarken anlamlı etkileri tespit etmek için yeterli gücü sağlar. Önyargıyı en aza indirmek için CT ve PS gruplarını tahsis ettikten sonra (grupların eşit temsilini sağlamak için), hayvan modeli ve veri analizi sırasında mümkün olduğunda araştırmacıların farelerin grubuna ve/veya genotipine kör olması sağlandı. Erkek ve dişi farelerin tepkilerinde farklılıklar bulmayı beklemesek de verileri cinsiyete göre inceledik. Deneylerde hem yaşları uyumlu erkek hem de dişi fareler kullanıldı. Transgenik farelerin kullanıldığı tüm deneylerde Littermate CT fareleri kullanıldı.

Hayvan çalışması onayı

Tüm hayvan bakımı ve deneyler, Fransa'da Avrupa Birliği (86/609/EEC) ve Fransız Etik Komitesi (87/848) politikalarına uygun olarak ve yerel bakanlık onaylı hayvan deneylerinde etik komitesinin (Etik Komite UMS006 CEEA-122; proje no. 21938-2019090417341270v5) özel onayıyla gerçekleştirildi. Hayvan tesisine vardıklarında hayvanlar, 2010/63/AB sayılı Avrupa Direktifine uygun olarak barındırıldı. Fareler, dişiler için üç, erkekler için iki kişilik gruplar halinde, %45-65 nem içeren, 20-24 °C sıcaklıktaki kafeslerde tutuldu ve yavrular, beşerli gruplar halinde barındırıldı.

Zamanlanmış gebelikler

W8 ila W10 erkek ve dişi fareler, zamanlı gebeliklere tabi tutuldu ve E0'da bir üreme diyetine (SAFE A03; %69,2 tahıllar, %6 hayvan proteinleri, %20,2 bitki proteinleri ve %4,6 vitamin ve mineraller) tanıtıldı. Başarılı çiftleşme, gebe kalma sonrası E0.5'i tanımlayan vajinal tıkaçların varlığına göre değerlendirildi. Dişi ağırlığı tüm gebelik dönemi boyunca izlendi ve gebelik, vücut ağırlığındaki önemli bir artışla doğrulandı; burada E0'dan E13'e kadar 3,5 g'dan fazla bir ağırlık artışı gebeliğin göstergesiydi. Yabani tip eşleşmeye ek olarak çiftleşme çiftleri şu şekilde tasarlandı: Kit^Wsh/Wsh olan kadınlar Kit^Wsh/Wsh erkekler, Kit^+/ olan kadınlar Kit^{+/ Wsh} erkekler ve aynı fikirde^{içeri/içeri} olan kadınlar Mcpt5-cre⁺ erkekler.

Kronik PS modeli

Daha önce açıklandığı gibi PS indüklendi⁷. Kısaca, hamile anneler rastgele CT ve PS gruplarına atfedildi. PS grubu daha sonra E13'ten E18'e kadar her biri 30 dakika boyunca günde 3 kez parlak bir ışık (200 W) altına yerleştirilen şeffaf delikli 50 ml'lik Falcon Tüplerinde (kafes başına en fazla 6 fare) kronik kısıtlama stresine maruz bırakıldı. CT'li hamile kadınlar rahatsız edilmeden bırakıldı. Dişi barajlar hamilelik boyunca her gün izlendi ve yuvalarını hazırlamak için bireysel kafeslere yerleştirildikleri son stres seansından sonra E18.5'e kadar iki veya üç hayvandan oluşan gruplar halinde barındırıldı. Doğumdan sonra tüm yavrular biyolojik anneleriyle aynı kafeste tutuldu. Yavrular daha sonra 21-28 günlük yaşta farklı cinsiyet gruplarında yeni kafeslerde sütten kesildi ve bir bakım diyetiyle tanıştırıldı (SAFE A04; %84,1 tahıllar, %4 hayvansal proteinler, %8 bitki proteinleri ve %3,9 vitamin ve mineraller). Deneyler istenilen yavru yaşında gerçekleştirildi.

Metirapon tedavisi

CT ve PS barajlarına intraperitoneal olarak 50 µg g enjekte edildi.⁻¹ metirapon (Bio-Techne), bir kez E11 ve E12'de ve E13'ten E18'e kadar her stres seansından 30 dakika önce. Enjeksiyon şekli ve dozu, gebelik için gerekli seviyeleri korurken etkili bir kortikosteron sentezi inhibisyonu elde edecek şekilde belirlendi. Kortikosteron dozajına yönelik serum, E18.5'teki son stres seansından hemen sonra toplandı ve kortikosteron konsantrasyonları açısından değerlendirildi.

Rahim içi tamoksifen uygulaması ve kader haritalaması

İçin Cdh5 -creERT2kader haritası, ROSA^mT/mG veya ROSA^Tdt/Tdt dişiler zamanlanmış çiftleştirmelere tabi tutuldu Cdh5-creERT2^+/− ROSA^mT/mG veya ROSA^Tdt/Tdtsırasıyla. Yavrularda raportör rekombinasyonunun indüksiyonu için, E7.5 veya E10.5'te hamile kadınlara intraperitoneal enjeksiyonlarla tek bir doz 4OHT verildi. Cre ifade edildiğinde Cdh5-creERT2;ROSA^Tdt Ve Cdh5-creERT2 ;ROSA^mT/mG farelerde, loxP-yanlı durdurma kasetini keserek Tdt'nin ekspresyonuna veya floresansın sırasıyla kırmızıdan (mT) yeşile (mG) geçişine izin vererek Cre eksprese eden hücreleri ve bunların soyundan gelenleri kalıcı olarak işaretler. 4OHT'nin gebelikler üzerindeki olumsuz etkilerini ortadan kaldırmak için 4OHT solüsyonlarına progesteron eklendi. Dişilere 1,2 mg 4OHT ve 0,6 mg progesteron dozu verildi. Hamile barajlar daha sonra PS'ye tabi tutuldu ve yavrulara E18.5, W8 ve W24'te ötenazi uygulandı. Dişilerin doğal yollarla doğum yapamadığı durumlarda yavrular sezaryenle doğurtuldu ve emziren CD1 dişilerle çapraz beslendi.

Hafif ıslak cilt sürtünmesinin modeli

Farenin sırt derisi tıraş edildi ve her 2 günde bir Tegaderm Şeffaf Pansuman (3M Health Care) ile kapatılan PBS dolgulu gazlı bezle tedavi edildi. 5. günde gazlı bezler çıkarıldı ve fareler 2 gün boyunca herhangi bir tedavi uygulanmadan bırakıldı. Bu döngü ekstra 2 hafta daha tekrarlandı. Son tedavi döngüsünden iki gün sonra farelere ötenazi uygulandı ve analiz için tedavi edilen alanlara karşılık gelen arka deri örnekleri alındı. Deri iltihabı, epidermal kalınlığın tarafsız ölçümüyle derecelendirildi. Sadece yama yapılan bölgede bulunan deri lezyonları değerlendirmeye alındı.

Bant sıyırma ve TEWL ölçümlerinin hafif modeli

W3 ve W8-W12 farelerinin arka derileri elektrikli bir tıraş makinesi kullanılarak tıraş edildi. Cilt bariyerini bozmak için bant şeritleri (otoklav bantları) tıraş edilen bölgeye sıkıca bastırıldı ve uygulamadan hemen sonra çıkarıldı. Bu prosedür 1. günde (W8 için beş bant şeridi ve W3 için üç bant şeridi) ve 6. günde (W8 için iki bant şeridi ve W3 için üç bant şeridi) tekrarlandı. Bandı akıcı bir vuruşla çıkarmak için cımbız kullanıldı. Mukavemet ve uygulanan basınç farklılıklarından kaynaklanan herhangi bir sapmayı önlemek için bant şerit uygulaması her zaman aynı kişi tarafından gerçekleştirildi. Bariyer geçirgenliği TEWL ölçümleri kullanılarak izlendi (g m cinsinden)⁻²H⁻¹ ) optimal oda koşullarında (sıcaklık 20 °C; %40-60 bağıl nem) kaydedilmiştir. Tewameter probu (kablosuz açık oda probu; Courage + Khazaka elektronik), difüzyon yasasına göre iki çift sensör (sıcaklık ve bağıl nem) aracılığıyla dolaylı olarak deriden su buharlaşmasının yoğunluk gradyanını ölçer. Farelere 8. günde ötenazi uygulandı ve bantla soyulmuş deriye karşı CT toplandı.

Multipleks yakınlık uzatma testi (Olink)

Cilt kesitleri, proteaz inhibitör kokteyl tabletleri (cOmplete Mini EDTA içermeyen tabletler; EASYpack; Roche) ile desteklenmiş RIPA Lizis Tamponunda (1:10; EMD Millipore Sigma-Aldrich) bozuldu ve CKMix boncukları (Bertin) ve Precellys 24 homojenleştirici kullanılarak homojenleştirildi. Daha sonra cilt kesitleri 20 saniye boyunca 6.500 rpm'lik iki döngüyle işlendi. Berraklaştırılmış dokunun protein konsantrasyonları Pierce BCA Protein Tahlil Kitleri (Thermo Fisher Scientific) ile ölçüldü. Numuneler daha sonra 0,5 mg ml- konsantrasyonuna normalleştirildi.⁻¹1× RIPA Parçalama Tamponu ile.

Elde edilen deri lizatları, amniyotik sıvı ve serum numuneleri, dahili (inkübasyon, uzatma ve saptama CT'leri) ve harici CT'lerin varlığında Olink Target 48 Fare Sitokin paneli kullanılarak bir yakınlık uzatma tahlili kullanılarak analiz edildi. Veriler bir ön işleme normalleştirme prosedürü kullanılarak analiz edildi. Her numune ve veri noktası için, uzatma CT'sine ilişkin karşılık gelen nicelik döngüsü (Cq) değeri çıkarıldı, böylece tek çalıştırmada teknik varyasyon için normalleştirme yapıldı. Daha sonra her bir test için çalışmalar arasındaki normalizasyon, üç kalibratör replikatının medyanı için karşılık gelen ΔCq değerinin, oluşturulan ΔCq değerlerinden çıkarılmasıyla gerçekleştirildi. Oluşturulan normalleştirilmiş protein ekspresyon birimi, bir log bazında oluşturuldu.₂ ölçek. Standart konsantrasyon birimlerindeki protein konsantrasyonu (pg ml cinsinden)⁻¹), normalleştirilmiş protein ekspresyon değerinin standart bir eğriye yerleştirilmesiyle elde edildi. Sonuçlar standart konsantrasyon birimlerinde (pg ml cinsinden) rapor edildi.⁻¹).

Mekanik alloknez testi

W8-W12 farelerinin ense kısmı traş edildi ve 30 dakika boyunca deney odasında ve ardından allokinesis testinden bir gün önce aynı boyuttaki Pleksiglas kutularda 30 dakika boyunca iklime alıştırıldı. Aynı alışkanlık test gününde de gerçekleştirildi. Her fare, iki von Frey filamentinden (0,07 g ve 0,4 g; Bioseb BIO-VF-M) ense kısmından beş zararsız mekanik uyaran aldı. Her uyarıdan sonra farelerin tepkisi puanlandı (0, tepki yok; 1, baş hareketi; 2, filamana doğru hareket; 3, kaşınma) ve toplam tepkinin yüzdesi çizildi.

Yapışkan bant tahlili

W8-W12 fareleri, deney odasında 30 dakika boyunca ve ardından 20 dakika boyunca Pleksiglas kutularda iklimlendirildi. Beyaz 12,7 mm'lik dairesel bir yapışkan bant, farelerin sırtının üst kısmına, omuzların arasına nazikçe yerleştirildi. Farelerin bantla yönlendirilen tepkileri aşağıdaki gibi izlendi⁶⁷: ıslak köpek sarsıntısı, bir maç; burnuyla kasete ulaşmaya çalışıyorum, bir maç; arka ayakla yönlendirilmiş kaşınma patlaması, bir maç; ön pençeyle boyun bakımı, bir maç; başın, sırtın alt kısmının, patilerin, bacakların ve karın bölgelerinin veya kuyruğun tımarlanması, nöbet yok. Fare bandı çıkarmayı başardığında veya 5 dakikalık bir deneme süresinden sonra kayıt durduruldu. Aşağıdaki parametreler analiz edildi: banttan kurtulma (başarı/zaman aşımı), toplam deneme süresi boyunca toplam nöbet sayısı ve dakika başına nöbet sayısı, yanıt süresi yok (15 saniye veya daha fazla süreyle hiçbir nöbetin meydana gelmediği sürenin toplamı) ve zaman süreci grafiğinin eğrisi altındaki alan olarak temsil edilen nöbetlerin zaman süreci (zamana karşı kümülatif nöbetler). Fisher'in kesin testi, PS'nin, bandı zamanında çıkarmayı başaran farelerin oranını etkileyip etkilemediğini test etmek için kullanıldı. Maçların zaman dilimleri saniye başına çizildi ve ardından her zaman noktası için ortalaması alındı. Bu ortalama zaman akışı eğrilerinin altındaki alan (0 nöbetteki taban çizgisi), her Δ için yamuk kuralı kullanılarak hesaplandı.X = GraphPad Prism kullanılarak 1 sn. Elde edilen ortalamalar ± sem ve toplam nöbetlerin ve dakika başına toplam nöbetlerin ortalamaları daha sonra iki yönlü ANOVA ve ardından Holm-Šidák çoklu karşılaştırma testleri ile istatistiksel olarak analiz edildi.

von Frey filaman testi

W8–W12, test alanında 1 saat boyunca iklime alıştırıldı. Artan önceden belirlenmiş kuvvetleri sağlayan artan çaplı filamentler, bükülene kadar farenin arka pençe yüzeyine dik olarak uygulandı. Başlangıç ​​filamanı olarak 0,02 g von Frey filamanı kullanıldı. Daha sonra 0,04 g, 0,07 g, 0,16 g, 0,4 g, 0,6 g, 1,4 g ve 2 g'lık filamentler kullanıldı. Sondalama sırasında veya filaman çıkarıldıktan hemen sonra pençeyi geri çekme, yalama veya sallama dahil herhangi bir canlı davranış, olumlu bir tepki olarak kabul edildi. Her fare için pençe çekilme eşiği, beş denemeden üçünde pozitif tepkiye neden olan filaman kuvveti olarak belirlendi.

Pasif kutanöz anafilaksi

W8 yavrularının kulaklarına, 20 ul PBS içindeki bir MrgprB2 agonisti olan 8 µg siprofloksasin intradermal olarak enjekte edildi. Kulak şişmesi, hafif anestezi (%2 izofluran) altında her 10 dakikada bir ölçüldü, enjeksiyondan hemen önce (T0) başlayıp enjeksiyondan 2 saat sonra sona erdi (T120).

Fıstık kaynaklı anafilaksi

Fareler, 100 ul su (HCO3) içindeki 10 μg kolera toksini (Sigma-Aldrich) ile birlikte 1 mg fıstık ekstraktı (cilt testi için kullanılan klinik dereceli preparatlar; Stallergenes Laboratories) ile duyarlı hale getirildi.₃⁻ ) 4 hafta boyunca haftada bir kez oral gavaj yoluyla uygulanır. Yer fıstığı ekstraktı ile son duyarlılaştırmadan bir hafta sonra, farelere 100 ul PBS içindeki 1 mg ham fıstık ekstraktının (Greer Laboratories) intraperitoneal enjeksiyonu uygulandı. Rektal sıcaklık ölçümleri, tehditten hemen önce (T0) başlayarak ve tehditten 2 saat sonra (T120) sona erecek şekilde her 30 dakikada bir gerçekleştirildi.

Astım ve akciğer ayrışmasının kısa modeli

W8 yavruları, 0. günde (D0) lipopolisakaritin ve PBS'nin veya 20 ug (30 ul) HDM suşunun intranazal uygulanmasıyla duyarlılaştırıldı. Dermatophagoides pteronyssinusD1 ve D8'de genel anestezi altında (farenin burnundan nefes alabilmesi ve sıvıyı soluyabilmesi için çok uzun değil). D11'de farelere ötenazi uygulandı ve akciğerler toplandı ve mekanik ve enzimatik ayrışma kullanılarak ayrıştırıldı. Kısaca, akciğer lobları Miltenyi C Tüplerinde RPMI ortamında toplandı ve daha sonra 0.5 mg ml- ile sindirildi.⁻¹ DNaz I (Sigma-Aldrich) ve 0,25 mg ml⁻¹ Miltenyi GentleMACS (protokol: fare akciğerleri) kullanılarak Liberase (Roche). Daha sonra hücre süspansiyonları filtrelendi ve kırmızı kan hücreleri, 5 dakika boyunca amonyum klorür-potasyum lizis tamponu kullanılarak parçalandı. Pelet geri kazanıldı ve FACS analizi için boyandı.

Resiniferatoksin tedavisi

TRPV1'i ablasyona uğratmak için⁺ nosiseptörler, W4 CT veya PS farelerine, 30, 70 ve 100 μg kg-1'lik artan RTX dozları deri altından enjekte edildi⁻¹Art arda üç gün boyunca 100 ul PBS'de. Bazı farelere 100 ul PBS içerisinde benzer hacimlerde dimetil sülfoksit (DMSO) enjekte edildi. Dört hafta sonra denervasyon, klasik kuyruk vuruşu tahlili kullanılarak değerlendirildi.

Kimyasal sempatektomi

6-OHDA (Sigma), tuzlu su çözeltisi içindeki araç çözeltisi (%0.01 askorbik asit) içinde çözüldü. CT ve PS farelerine iki intraperitoneal 6-OHDA enjeksiyonu (150 mg kg-1) verildi.⁻¹ ) 24 saatlik aralıklarla. Fareler, ilk enjeksiyondan 2 gün sonra kurban edildi ve görüntüleme analizi için sırt derisi toplandı.

Bölüm hazırlama, histoloji, immünofloresan ve konfokal mikroskopi

Fare numuneleri ya optimal kesme sıcaklığı bileşiğinde (Tissue-Tek) donduruldu ya da %10 formalinde sabitlenip parafine gömüldü. Isı kaynaklı epitop alma yöntemi (10 mM sodyum sitrat tamponunda (pH 6.0) kullanılarak ön işleme tabi tutulan dondurulmuş veya parafine gömülmüş fare derisi bölümleri, PBS %0,5 (a/h)% BSA ve %0,3 Triton X-100'de 30 dakika süreyle geçirgenleştirildi ve florofor bağlı antikorlar veya konjuge olmayan antikorlarla gece boyunca 4 °C'de inkübe edildi: anti-Filaggrin (Ozyme; BLE905801; 1:50), anti-Loricrin (Ozyme; BLE905101; 1:50), anti-fare Keratin 6A (Ozyme; BLE905701; 1:50), Anti-Claudin 1 antikoru (Abcam; ab15098; 1:50), Alexa Fluor 647 anti-fare CD45 (BioLegend; 103124; 1:400), anti-TH (Sigma; AB1542; 1:100), Alexa Fluor 647 anti-Tubulin β3 (BioLegend; 801210; 1:50), anti-insan/fare GFRa2 (R&D Systems; AF429; 1:200), anti-fare NFH (Sigma; AB1989; 1:1.000), anti-GFP (Proteintech; pabg1; 1:200), anti-RFP (Takara; 632496; 1:200), Anti-Madde P (Merck Millipore; MAB356; 1:200) ve anti-αSMA (Thermo Fisher Scientific; 14-9760-82; Klon 1A4; 1/100). Kesitler daha sonra 3 kez PBS %0,5 (a/h) BSA ve %0,3 Triton X-100'de yıkandı ve gerekirse PBS %0,5 (a/h) % BSA ve %0,3 Triton X-100'de aşağıdaki ikincil antikorlarla karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edildi: Eşek anti-Fare IgG (H+L) Yüksek Derecede Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 647 (Invitrogen; A31571; 1:200), Keçi anti-Tavşan IgG (H+L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 594 (Invitrogen; A11012; 1:200), Eşek anti-Koyun IgG (H+L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 568 (Invitrogen, A21099; 1:200), Keçi anti-Tavşan IgG (H+L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 (Invitrogen; A11008; 1:200) ve Keçi anti-Sıçan IgG (H+L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific; A21247; 1:200). Slaytlar daha sonra yıkandı, Mowiol ortamına yerleştirildi ve bir lamel ile kapatıldı. Z yığını görüntüleri (512 x 512), Leica STELLARIS, Leica SP8 ve Zeiss LSM 710 Meta ters konfokal lazer tarama mikroskopları kullanılarak elde edildi ve ImageJ (v.2.16.0) ve Imaris (Bitplane; v.9.5.1) yazılımı kullanılarak işlendi. Temel epidermal proteinlerin MFI'leri, üst üste binmeyen üç bölümdeki (aynı toplam piksel sayısı) aynı alanların rastgele seçilmiş epidermal bölgeleri üzerinde ImageJ yazılımının (v.2.16.0) 'ölçüm fonksiyonu' kullanılarak analiz edildi. Nöronların hücre gövdeleri, fare başına üst üste binmeyen üç DRG bölümünün (alt torasik bölgeden üst lomber DRG'ye) en az üç görüntüsünde sayıldı. Veriler Tdtomato yüzdesi olarak sunuldu⁺ nöronlar.

Hematoksilen ve eozin

Fare sırt derisi bölümleri, histopatoloji departmanı CREFRE U006'daki standart prosedürlere göre boyandı. Slaytlar daha sonra Pannoramik Dijital Slayt Tarayıcı (3DHISTECH) kullanılarak tarandı. Epidermal kalınlığın ölçümü için, stratum korneum ile epidermisin bazal tabakası arasındaki mesafenin rastgele seçilen üç ölçümü, slayt görüntüleme uygulaması CaseViewer 2.3 kullanılarak kaydedildi.

Derideki nöronların filaman uzunluğunun hesaplamalı analizi

3D yüksek çözünürlüklü görüntüler, yukarıda açıklandığı gibi bir Leica TCS SP8 MP Meta ters konfokal mikroskop kullanılarak çekildi. Görüntüler daha sonra Imaris (Bitplane; v.9.5.1) yazılımı kullanılarak işlendi. Tubβ3'ün yörüngelerinin ve şekillerinin hassas bir şekilde izlenmesi için Tubβ3, TH, IB4, NFH ve Gfα2 kanallarında filament izleme algoritması uygulandı.⁺ (pan nöronal işaretleyici), TH⁺ (arka deri, esas olarak c-LTMR'ler ve sempatik nöronları da lekeleyebilir), Tubβ3⁺ IB4⁺ nöronlar (sırt derisi vepeptiderjik olmayan), NFH⁺ (tüysüz cilt ve LTMR'ler) ve Gfrα2⁺ (tüysüz cilt vepeptiderjik olmayan). Daha sonra filaman izleri hesaplandı ve filaman uzunluklarının toplamı hesaplandı ve tüm numuneler için milimetre kare başına normalleştirildi.

Fare dokusu enzimatik sindirimi ve gradyan ayrımı

Embriyonik ve yetişkin fare dokularından hücre süspansiyonları, mekanik ayrışma ve enzimatik sindirim yoluyla elde edildi. Kısaca, W8 veya W24 farelerinin yetişkin sırt derisi, sindirim öncesi ortamda toplandı, ince bir şekilde kıyıldı ve epitel hücrelerini ve diğer yabancı maddeleri çıkarmak için 37 °C'de dönen bir plaka üzerinde inkübe edildi. Daha sonra numuneler, dokuyu ayrıştırmak için 1,25 mg Liberase (Sigma) ve 2,5 mg DNAse I (Sigma) ile döner bir plaka üzerinde 45 dakika süreyle sindirildi. Numuneler Miltenyi GentleMACS Dissociator ile daha da ayrıştırıldı ve hücreler daha sonra bir Percoll gradyanı ile zenginleştirildi.

Fetal deri toplandı, ince kıyıldı ve 0.1 mg ml- içeren RPMI ortamında sindirildi.⁻¹ DNAz I (Sigma), 400 U ml⁻¹ Kollajenaz I (Sigma), 0,1 mg ml⁻¹ Liberase DL (Roche) ve 1 mg ml⁻¹Dispase II'nin (Roche) 37 °C'de dönen bir plaka üzerinde 45 dakika süreyle karıştırılması. Sindirilen doku örnekleri filtrelendi.

Daha sonra akış sitometrisi için tek hücreli süspansiyonlar kullanıldı.

Akış sitometrisi

Hücre süspansiyonları, fare karşıtı CD16/32 (S17011E; BioLegend) ile 4 °C'de 15 dakika süreyle bloke edildi. Yüzey boyama, aşağıdaki antikorlar kullanılarak FACS tamponunda 1 saat boyunca 4 °C'de gerçekleştirildi: anti-fare CD45 BV786 (BD Biosciences; 564225; 1:200), anti-fare/insan CD11b Brilliant Violet 605 (BioLegend; 101237; 1:200), anti-fare CD117 SB436 (Thermo Fisher Scientific; 62-1171-82; 1:200), fare karşıtı CD117 PE (BioLegend; 105807; 1:200), fare karşıtı Ly6C Alexa Fluor 488 (BD Biosciences; 553104; 1:200), fare karşıtı Ly6G APC Cy7 (BD Biosciences; 560600; 1:200), anti-fare/insan CD207 PE-Cy7 (BioLegend; 144209; 1:200), PerCP/Cyanine5.5 anti-fare CD3 (BD Biosciences; 551163; 1:200), BV650 Anti-Fare γδ T-Hücre Reseptörü (BD Biosciences; 563993; 1:200), fare karşıtı CD4 PE Cy7 (BD Biosciences; 552775; 1:200), Alexa Fluor 488 fare karşıtı CD8 (BioLegend; 100726; 1:200), fare karşıtı CD25 PE (BD Biosciences; 553075; 1:200), fare karşıtı NK1.1 APC Cy7 (BD Biosciences; 560618; 1:200), fare karşıtı Nkp46 BV605 (BioLegend; 137619; 1:200), anti-insan/fare KLRG1 BV421 (BioLegend; 138413; 1:200), fare karşıtı CD11c PE CF594 (BD Biosciences; 562454; 1:200), fare karşıtı MHCII AF700 (BioLegend; 107621; 1:200), fare karşıtı CD24 PE Cy7 (BD Biosciences; 560536; 1:200), fare karşıtı F4/80 BV711 (BioLegend; 123147; 1:200), fare karşıtı CD170 (Siglec F) eFluor 660 (Thermo Fisher Scientific; 50-1702-82; 1:200), Alexa Fluor 647 fare karşıtı CD64 (BD Biosciences; 558539; 1:200), fare karşıtı ST2 APC (BioLegend; 146605; 1:200), anti-fare FcERI PE (Miltenyi; 130-118-896; 1:200) ve anti-fare FcERI PE-Cy7 (BioLegend; 134317; 1:200). Veriler bir BD FACSymphony sitometresinde elde edildi ve FlowJo (Tree Star; v.10.10.0) yazılımı kullanılarak analiz edildi. Hücre sıralaması BD FACSAria'da yapıldı.

İmmün hücre popülasyonları aşağıdaki şekilde kapılandı:

γδ T hücreleri: CD45⁺CD11b⁻Ly6G⁻CD3⁺ TCRγδ⁺

CD4⁺T hücreleri: CD45⁺CD11b⁻Ly6G⁻CD3⁺TCRγδ⁻CD4⁺ CD8⁻

CD8⁺T hücreleri: CD45⁺CD11b⁻Ly6G⁻CD3⁺TCRγδ⁻CD4⁻CD8⁺

Düzenleyici T hücreleri: CD45⁺CD11b⁻Ly6G⁻CD3⁺CD25⁺

Doğal öldürücü hücreler: CD45⁺CD11b⁻Ly6G⁻CD3⁻NK1.1⁺

Doğal öldürücü T hücreleri: CD45⁺CD11b⁻Ly6G⁻CD3⁺NK1.1⁺

ILC2: CD45⁺CD11b⁻Ly6G⁻Nkp46⁻KLRG1⁺

ILC3: CD45⁺CD11b⁻Ly6G⁻Nkp46⁺KLRG1⁻

Dermal dendritik hücre: CD45⁺CD11b⁺CD11c⁺MHC2⁺

Langerhans hücresi: CD45⁺CD11b⁺CD24⁺

Nötrofil: CD45⁺CD11b⁺Ly6C⁺Ly6G⁺

Monosit: CD45⁺CD11b⁺Ly6C⁺Ly6G⁻

Makrofaj: CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺

Alveoler makrofaj (yetişkin akciğer): CD45⁺CD11c⁺Siglec-F⁺MertK⁺

Bazofil: CD45⁺CD117⁻FceRI⁺

Eozinofil: CD45⁺CD11b⁺Siglec-F⁺

Mast hücresi (yetişkin dokular): CD45⁺CD11b⁻CD117⁺FceRI⁺

Mast hücresi (fetal cilt): CD45⁺F4/80⁻CD64⁻CD117⁺ ST2⁺

Tüm hücreler, canlı (SYTOX canlılık boyası kullanılarak) singlet'ler olarak önceden hazırlandı.

Doku RNA ekstraksiyonu

Yetişkin farelerden alınan deri örnekleri veya DRG, hemen RNA'da saklandı ve ardından Miltenyi GentleMACS Dissociator ile TRIzol'de ayrıştırıldı. Üreticinin yönergelerine göre RNeasy Qiagen Mini Kit kullanılarak doku RNA'sı ekstre edildi. Fetal mast hücreleri yukarıda açıklandığı gibi sıralandı. Daha sonra RNA, üreticinin yönergelerine göre RNeasy Qiagen Micro Kit kullanılarak ekstre edildi. RNA kalitesi ve titreler NanoDrop kullanılarak analiz edildi. RNA, toplu RNA dizisi veya gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) için kullanıldı.

Toplu RNA-seq için kitaplıkların hazırlanması

Örnek kalitesinde CT ve kütüphaneler GeT-Santé tesisinde hazırlandı^38,39. RNA konsantrasyonu ve saflığı, bir NanoDrop 2000 spektrofotometre (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak belirlendi. RNA'nın bütünlüğü, RNA standart duyarlılık kiti kullanılarak bir Parça Analizörü (Agilent Technologies) ile kontrol edildi. 260/280 saflık oranlarının tümü 1,8'den büyüktü. Bütünlük endeksleri, RNA bütünlük sayısı (8,2–8,6) ve 28S/18S oranları (0,8–1,2) için kabul edilebilir ve homojen değerler ortaya çıkardı. RNA-seq eşleştirilmiş uç kütüphaneleri, TruSeq Stranded mRNA kütüphane hazırlama Kiti (Illumina) kullanılarak Illumina protokolüne göre bazı ayarlamalarla GeT-Santé tesisinde hazırlandı. Kısaca, haberci RNA'lar ilk olarak poli-T boncukları kullanılarak 3.000 ng (DRG dizilimi) veya 500 ng (sıralanmış fetal mast hücre dizilimi) toplam RNA arasından seçildi. Daha sonra RNA'lar 2' boyunca parçalandı ve çift sarmallı tamamlayıcı DNA (cDNA) oluşturmak için retrotranskript edildi. Uyumlu adaptörler bağlanarak numunelerin benzersiz tek indekslerle barkodlanmasına olanak sağlandı. Kütüphaneleri büyütmek için on bir döngü polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) uygulandı ve ekstra iki boyutlu bir saflaştırma adımının 280-1.000 pb fragman elde etmesine izin verildi. Kütüphanelerin kalitesi, Fragment Analizöründeki (Agilent Technologies) HS NGS kiti kullanılarak değerlendirildi.

Toplu RNA dizisi

Kütüphanelerin miktarının belirlenmesi ve sıralanması GeT-PlaGe çekirdek tesisinde (Institut National de Recherche pour l'Agriculture, l'Alimentation et l'Environnement) gerçekleştirildi. Kütüphanelerin niceliği, doğru bir nicelik elde etmek için KAPA Kütüphane Kantifikasyon Kiti (Roche) kullanılarak qPCR aracılığıyla belirlendi. Kitaplıklar eşit molar olarak havuzlandı ve daha sonra NovaSeq 6000 S prime v.1 Reaktif Kiti (300 döngü) ve eşleştirilmiş uç 2 x 150-pb stratejisi kullanılarak Illumina NovaSeq 6000 cihazının (Illumina) bir S prime şeridinde RNA-seq gerçekleştirildi.

Sıralama kalitesini değerlendirmek için dizi okumalarında FastQC gerçekleştirildi. Okumalar daha sonra STAR (v.2.4.0) kullanılarak referans genom olarak GRCm39 (mm10) üzerinde hizalandı.⁶⁸ hizalayıcı ve HTseq (v.0.9.1) ile sayılır⁶⁹ve bir sayma matrisi oluşturuldu. Sayım matrisi değerleri, DESeq2'de (v.1.34.0) uygulanan düzenli log dönüşümü kullanılarak dönüştürüldü⁷⁰. Veri araştırmasını RStudio (v.2024.12.1) kullanarak gerçekleştirdik.

ScRNA-seq için kütüphanelerin hazırlanması

Üreticinin protokolüne (10x Genomics) göre Chromium Next GEM Tek Hücreli 3′ Reaktif Kitleri v.3.1 kullanılarak numune başına yaklaşık 16.000 hücre damlacıklar halinde kapsüllendi. Kısaca, Next GEM Chip G kullanılarak nanolitre ölçekli EMülsiyondaki Jel boncuk (GEM) oluşturulduktan sonra, GEM'ler, 53 ° C'de 45 dakika boyunca ve 85 ° C'de 5 dakika boyunca programlanan ve 4 ° C'de tutulan bir C1000 Dokunmatik Termal Döngüleyicide (Bio-Rad) ters kopyalandı. Ters transkripsiyondan sonra tek hücreli damlacıklar kırıldı ve cDNA izole edildi ve Dynabeads içeren Clean-Up Mix (Thermo Fisher Scientific) ile temizlendi. Daha sonra cDNA, 98 °C'de 3 dakika, 12 döngü (98 °C 15 saniye, 63 °C 20 saniye ve 72 °C 1 dakika) ve 72 °C'de 1 dakika programlanmış bir C1000 Touch Thermal Cycler ile büyütüldü ve 4 °C'de tutuldu. Daha sonra, amplifiye edilmiş cDNA parçalandı, ucu onarıldı, A-kuyruklu, indeks adaptörü bağlandı ve adımlar arasında SPRIselect Reaktif Kiti (Beckman Coulter) içeren Temizleme Karışımı ile temizlendi. Ligasyon sonrası ürün, 45 saniye boyunca 98 °C'de, 14 döngü (20 saniye boyunca 98 °C, 30 saniye boyunca 54 °C ve 20 saniye boyunca 72 °C) ve 1 dakika boyunca 72 °C'de programlanan bir C1000 Touch Thermal Cycler ile büyütüldü ve indekslendi ve 4 °C'de tutuldu. Sıralamaya hazır kütüphaneler SPRIselect boncuklarıyla temizlendi.

10x Genomics teknolojisi kullanılarak hazırlanan kütüphaneler toplandı ve NovaSeq 6000 S prime Reaktif Kiti v.1.5 (200 döngü) ve aşağıdaki sıralama parametreleri kullanılarak NovaSeq 6000 cihazının (Illumina) bir S prime şeridinde %1 PhiX ile yüklendi: 28 bp okuma 1, 8 bp indeks 1 (i7) ve 150 bp okuma 2. S prime şeridi toplam 434 × 10 oluşturuldu⁶ okur.

Tek hücreli RNA sıralama analizi

Ön işleme

Transkript okumalarının çoğullaması çözüldü, referans fare genomuna (mm10 - GENCODE vM23/Ensembl 98) göre hizalandı ve Cell Ranger v.7.0.1 (ref.⁷¹). Numunelerin niceliksel gen sayımları, celda paketi v.1.6.0'dan (ref.⁷²). Her numunenin Cell Ranger sayısının ham filtrelenmemiş matris çıktısı, ortam RNA çıkarımı için ilgili arka plan olarak kullanıldı. Seurat paketi v.4.3.0.1 (ref.⁷³) ana analiz grubu olarak tercih edildi. Okunmalarının %10'undan fazlasını içeren hücreler mitokondriyal genlere atandı ve 100'den az tespit edilen gen içeren hücreler veri kümesinden çıkarıldı. Bu kalite kontrol düzeltmesinden sonra toplam 28.015 hücre (CT W8'den 7.211 hücre, PS W8'den 4.474 hücre, CT W24'ten 6.812 hücre ve PS W24'ten 9.004 hücre) daha ileri analiz için tutuldu.

İşleme

Daha sonra Seurat standart analiz hattını çalıştırdık: normalizasyon, oldukça değişken genlerin bulunması, ölçeklendirme ve PCA. Temel bileşen boyutlarının varyans açıklanabilirliği gözlemlendi ve ilk 20 temel bileşen, alt analiz için seçildi. Veri seti, Harmony paketi v.1.0.3 (ref.⁷⁴), ilk 20 temel bileşen boyutunun dahil edilmesiyle. k-en yakın komşu grafiği, UMAP ve t-dağıtımlı stokastik komşu yerleştirme projeksiyonları, ilk 20 düzeltilmiş temel bileşen temelinde hesaplandı. Veri seti içindeki farklı toplulukları incelemek için, 0,3 çözünürlükte Louvain algoritması kullanılarak denetimsiz kümeleme gerçekleştirildi.

Hücre tanımlama

Hesaplanan denetlenmeyen hücre kümelerinin işaretleyici genlerini belirlemek için FindAllMarkers() işlevi kullanıldı. Kümelerimiz içindeki bir dizi kanonik işaretleyicinin ifadesini inceleyerek toplam 13 farklı hücre tipini başarıyla tanımladık: Cd3e , Itgae Ve Trdc γδ T hücrelerinin tanımlanması; Cd207 Ve Ly75 Langerhans hücrelerinin tanımlanması; Xcr1 Ve Flt3 dermal dendritik hücrelerin tanımlanması; Lyz2 Ve Mrc1 geleneksel makrofajların tanımlanması; Gzmb Ve NCR1 doğal öldürücü hücrelerin tanımlanması; Ms4a1 Ve Cd79b B hücrelerinin tanımlanması; S100a9 Ve S100a8 nötrofillerin tanımlanması; IL17a Ve Il23r ILC3'lerin tanımlanması; Ccr6 Ve Gata3 ILC2'lerin tanımlanması; EBM3 Ve Tpsb2 mast hücrelerinin tanımlanması; Ve Krt14 Keratinositleri tanımlamak.

Diferansiyel gen ekspresyonu analizi

Açıklamalı hücre türleri için, bir grubu diğeriyle karşılaştırmak amacıyla Seurat'ın FindMarkers() işlevi içindeki Poisson testi çalıştırıldı. Genler P_sıfat< 0,05 ve mutlak ortalama log₂Verilen DEG testinde 0,58'den büyük (kat değişimi) anlamlı olduğu belirlendi.

Tek çekirdekli Multiome ATAC ve Gen Ekspresyonu için kütüphanelerin hazırlanması

W8 ve W24, CT ve PS yavrularının arka derisi (N = 4) işlendi ve tek hücreli süspansiyonlar CD45 açısından zenginleştirildi⁺bağışıklık hücreleri.

Çekirdek izolasyonu

Tek Çekirdekli Multiom ATAC + Gen İfade Sıralaması protokolü (CG000365-Rev C) için 10x Genomik Çekirdek İzolasyonu izlenerek tek çekirdekler izole edildi. Kısaca, taze hücreler Countess 3 Otomatik Hücre Sayacı (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak sayıldı ve 150.000 hücre kullanıldı. Hücre topağı, 100 ul soğutulmuş %0.025 IGEPAL lizis tamponu (10x Genomics) içerisinde homojenleştirildi. Lizat 2 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edildi. Lizis sonunda 1 ml soğutulmuş yıkama tamponu (10x Genomics) ilave edildi. Santrifüjden sonra (500 bağıl santrifüj kuvveti; 5 dakika; 4 °C), süpernatan dikkatlice çıkarıldı ve çekirdekler, 1 ml yıkama tamponunda yeniden süspanse edildi. Çekirdek süspansiyonu daha sonra 40 mikronluk bir süzgeçten filtrelendi ve kalıntıları gidermek için toplam üç yıkama için santrifüjlendi (500 bağıl santrifüj kuvveti; 5 dakika; 4 °C). Çekirdek sayısına bağlı olarak pelet, mikrolitre başına 8.060 çekirdeğe sahip olacak şekilde 3,4 ila 15,5 ul seyreltilmiş çekirdek tamponu (10x Genomics) içerisinde yeniden süspanse edildi.

Tek çekirdekli bölümleme ve kitaplık hazırlama

Çekirdekler, 10x Genomics Chromium Next GEM Tek Çekirdekli Multiome ATAC + Gen Ekspresyonu protokolü (CG000338-Rev F) kullanılarak hemen tedavi edildi. Transpozisyondan sonra, çekirdekler optimum konsantrasyona kadar seyreltildi ve Chromium Next GEM Chip J'ye yüklendi, ardından Chromium X (10x Genomics) kullanılarak GEM'lere bölündü. GEM yırtılmasından sonra cDNA ve transpoze edilmiş DNA fragmanları, Dynabeads MyOne Silane (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak saflaştırıldı. Transpoze edilmiş DNA fragmanları, kromatin erişilebilirlik kütüphaneleri oluşturmak için yedi PCR döngüsü amplifikasyonuna tabi tutulurken, cDNA fragmanları, zenginleştirilmiş gen ekspresyon kütüphaneleri oluşturmak için uç onarım, adaptör ligasyonu ve on indeksleyici PCR döngüsü yoluyla daha da işlendi.

Sıralama

Ortaya çıkan gen ekspresyonu ve ATAC kütüphaneleri, bir Qubit Florometre (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak ölçüldü ve sekanslamadan önce bir Agilent TapeStation kullanılarak fragman boyutu dağılımı açısından analiz edildi. Kütüphaneler önerilen oranda bir araya toplanmış ve Toulouse Kanser Araştırma Merkezi Teknoloji Kümesi'ndeki (CRCT) bir Illumina NovaSeq 6000 platformunda eşleştirilmiş okumalar (okuma 1, 50 bp; okuma 2, 49 bp; dizin 1, 8 bp; dizin 2, 24 bp) ve eşleştirilmiş okumalar (okuma 1, 28 bp; okuma 2, 90) kullanılarak sıralanmıştır. bp; indeks 1, 10 bp; indeks 2, 10 bp), toplama sonrası 19.946 hücre için hücre başına 3.350 medyan fragmanlık bir sekanslama derinliği elde etmek amacıyla gen ekspresyonu için çekirdek başına yaklaşık 50.000 okuma çifti hedeflemektedir.

Multiome veri işleme ve entegrasyonu

Ön işleme ve kalite kontrol

ATAC-seq ve tek çekirdekli RNA-seq okumaları dahil olmak üzere tek çekirdekli multiom sekanslama verileri, Cell Ranger ARC (v.2.0.2) kullanılarak işlendi. Okumaların çoğullaması çözüldü, referans fare genomuna (mm10 - GENCODE vM23/Ensembl 98) göre hizalandı ve filtrelenmiş özellik matrisleri ve ATAC parça dosyaları oluşturmak için ölçüldü. Ortaya çıkan veri kümeleri, aşağı akış analizi için Seurat (v.5.1.0) ve Signac'a (v.1.14.0) yüklendi. Tüm numunelerden alınan ham okuma dosyaları, tek bir Seurat nesnesinde birleştirildi ve ardından düşük kaliteli veya birden fazla çekirdeği kaldırmak için kalite kontrol filtrelemesi yapıldı. Çekirdekler, aşağıdaki kriterleri karşılamaları durumunda tutuldu: (tek çekirdekli RNA dizilimi) 300 veya daha fazla RNA özelliği, toplam RNA sayısı 5.000'den az ve %10'dan az mitokondriyal RNA içeriği; (snATAC-seq) ATAC zirve sayıları 100 ila 20.000 arasında, nükleozom sinyali 0,75'ten az ve transkripsiyon başlangıç bölgesi zenginleştirme puanı 2'nin üzerinde. Filtrelemeden sonra toplam 12.499 yüksek kaliteli çekirdek aşağı akış analizi için tutuldu: CT W8'den 2.130 çekirdek, PS W8'den 4.094 çekirdek, CT W24'ten 3.767 çekirdek ve PS W24'ten 2.508 çekirdek.

Tek çekirdekli RNA dizileme veri işleme

Gen ekspresyonu değerleri log-normalize edildi ve ölçeklendi. Oldukça değişken genler tanımlandı; PCA, 50 temel bileşeni koruyarak gerçekleştirildi. Harmony kullanılarak toplu düzeltme uygulandı ve düzeltilen yerleştirmeler aşağı akış analizi için saklandı.

snATAC-seq veri işleme

Kromatin erişilebilirlik verileri için minimum beş okumalı zirveler tutuldu. Terim frekansı-ters belge frekansı normalizasyonu uygulandı, ardından 50 gizli semantik indeksleme bileşenini koruyan tekil değer ayrıştırması uygulandı. Harmony kullanılarak toplu düzeltme uygulandı ve düzeltilmiş yerleştirmeler saklandı.

Multiomik entegrasyon ve kümeleme

Ağırlıklı bir en yakın komşu grafiği, RNA ve ATAC verilerinden Harmony düzeltmeli yerleştirmeler kullanılarak oluşturuldu. RNA'dan ilk 50 boyut ve ATAC'tan 2-50 boyut kullanıldı. Ortak bir UMAP oluşturuldu ve 0,1 çözünürlükte Louvain algoritması kullanılarak kümeleme yapıldı. Hücre tanımlaması için yukarıda listelenenlere benzer işaretleyiciler kullanıldı.

Erişilebilir bölgelerin diferansiyel analizi

Kromatinin DAR'larını tanımlamak için deneysel koşullar arasında ikili karşılaştırmalar yapıldı. Analiz, kromatin erişilebilirlik verileri (ATAC tahlili) dikkate alınarak tek hücreli transkriptomik testinin model bazlı analiziyle Seurat'taki FindMarkers() işlevi kullanılarak gerçekleştirildi. Karşılaştırmalar PS W8'e karşı CT W8, PS W24'e karşı CT W24 ve PS W24'e karşı PS W8 grupları için araştırıldı. Yalnızca hücreler arasında minimum %5 tespit oranına sahip bölgeler dikkate alındı. DAR'larla ilişkili genlere, Signac paketinin (v.1.14.0) ClosestFeature() işlevi kullanılarak açıklama eklendi. Önemli DAR ile ilişkili genler, 0,05'lik yanlış keşif oranı eşiği ve bir log bazında tanımlandı.₂(katlama değişimi) kesme noktası 1,5. Her karşılaştırma için özet istatistikler kaydedildi ve sonuçlar, DAR'larla ilişkili genlerin sayısını gösteren nokta grafikleri kullanılarak görselleştirildi.

Gerçek zamanlı qPCR analizi

Hazırlama için rastgele heksamerler (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak SuperScript III First-Strand Synthesis System kiti (Invitrogen) ile toplam RNA ters transkripsiyonu için fare derisinden RNA (1 μg) preparatları kullanıldı. Kemokin (C-C motifi) ligand 20, timik stromal lenfopoietin, interferon-γ, IL'leri (IL-10, IL-12p35, IL-12p40, IL-13, IL-17A, IL-17F, IL-22, IL-4, IL-5 ve IL-6), onkostatin M'yi kodlayan transkriptler, retinoik asit reseptörüne bağlı yetim nükleer reseptör-γt, sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörü (Stat; Stat3, Stat4 ve Stat6) ve dönüştürücü büyüme faktörü-β1, spesifik ileri ve geri primerler, Takyon SYBR 2X MasterMix mavi dTTP kiti (Eurogentec) kullanılarak gerçek zamanlı PCR kullanılarak ölçüldü ve LightCycler 480 II (Roche Diagnostics) kullanılarak ölçüldü.

Toplam IgE ve kortikosteron enzimine bağlı immünosorbent tahlili

Kan örnekleri toplandı ve 15.000'de santrifüj edildi.G5 dakika boyunca Daha sonra serum toplandı ve kullanılıncaya kadar -20 °C'de saklandı. Toplam IgE titreleri ve kortikosteron konsantrasyonları, üreticinin tavsiyelerine uygun olarak bir enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA) kiti (sırasıyla Invitrogen ve Abcam) kullanılarak ölçüldü.

Mast hücre degranülasyon dinamiklerinin tek hücreli analizi

E18.5 fetal deriden alınan mast hücreleri (N = 24) sınıflandırıldı ve poli-D-lisin kaplı (5 µg ml⁻¹ ; Sigma-Aldrich) Tyrode tamponunda 37 °C'de 30 dakika boyunca kapak camlı (IBL Baustoff + Labor) altı oyuklu cam alt plakalar, 5 µg ml ile desteklenmiştir⁻¹ avidin-sülforhodamin 101 (avidin SRho; Sigma-Aldrich). Hücreler daha sonra araç (Tyrode ± kloroform (negatif CT)), 100 uM madde P (pozitif CT), 100 ng ml- ile uyarıldı.⁻¹ kortikosteron ve amniyotik sıvı (CT, PS, CT-Met ve PS-Met yumurta sarısı keselerinden). Leica Sp8 eş odaklı lazer tarama mikroskobu kullanılarak kontrollü bir atmosferde (objektif ısıtıcılı bir ZEISS aşamalı inkübasyon sistemi kullanılarak; 37 °C kullanılarak) 30 dakika sonra floresans kaydedildi. MFI, tanımlanan her tek hücre için ImageJ yazılımının ölçüm fonksiyonu kullanılarak ölçüldü.

DRG ayrışması, kültür ve kalsiyum görüntüleme

Tüm omurga seviyelerinden DRG, Hanks'in Ca ve Mg içermeyen dengeli tuz çözeltisinde toplandı ve 5 mg ml-karışımı ile sindirildi.⁻¹ dispaz ve 1 mg ml⁻¹ 37 °C'de 45 dakika boyunca kollajenaz tip I'in. DRG daha sonra yıkandı ve 0.15 mg ml- takviyeli DMEM'de artan ölçülü şırıngalarla daha da öğütüldü.⁻¹ DNAz I. Ayrışmadan sonra hücreler 300°C'de döndürüldü.Gve kapaklı Nunc Lab-Tek II CC2 Oda Slaytlarına (Thermo Fisher Scientific) kaplanmadan önce ortamda yeniden süspanse edildi. DRG, 50 ng ml- takviyeli DMEM'de 24 saat boyunca kültürlendi⁻¹ sinir büyüme faktörü ve 37 °C'de 1:50 NeuroCult (STEMCELL). Hücreler, görüntülemeden hemen önce HEPES/Hanks'in dengeli tuz çözeltisi içerisinde karanlıkta 37 °C'de 30 dakika süreyle Fluo-4 ile yüklendi. Hücreler bir taban çizgisi oluşturmak için 20 saniye boyunca görüntülendi. DRG daha sonra 100 uM β-alanin, 10 nM kapsaisin, 2 nM MRS2365 veya 400 ng ml- ile uyarıldı.⁻¹kortikosteron. Her görüntüleme denemesinin sonunda pozitif CT olarak 50 mM KCl eklendi. Hasar görmüş, ayrılmış, yüksek taban çizgisi ve hareketle aktive olan hücreler analizin dışında bırakıldı.

Hamile kadınlar kohortu ve kortizol ELISA

Bu çalışma tanımlayıcıyla kaydedildi NCT05207059 ClinicalTrials.gov'da³⁷. Tüm denekler, Singapur'daki SingHealth Merkezi Kurumsal İnceleme Kurulundan gerekli etik onaylar alındıktan sonra işe alındı ​​ve her katılımcı için bilgilendirilmiş onam alındı. Uygun katılımcılar, vücut kitle indeksi 25-40 kg m2 olan 21-40 yaş arası kadınlardı.⁻²; önümüzdeki 4 yıl boyunca Singapur'da ikamet etmeyi planlayan; Çinli, Malay, Hintli veya bu etnik grupların bir kombinasyonu olarak tanımlanmak; ve bir yıl içinde hamile kalmayı planlıyorum. Hariç tutma kriterleri mevcut hamileliği içeriyordu; bilinen tip 1 veya tip 2 diyabet; ve antikonvülzanların, oral steroidlerin, bazı doğum kontrol yöntemlerinin, doğurganlık tedavilerinin veya insan bağışıklık yetersizliği virüsü veya hepatit B/C'ye yönelik ilaçların yakın zamanda (geçen ay) kullanımı. Anne kanı hamile kadınlardan iki farklı zaman noktasında toplandı: 6-10 gebelik haftaları ve doğum sırasında. Taze işlenmiş kan, BAT kullanılarak bazofil reaktivitesini değerlendirmek için kullanıldı. BAT daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirildi⁷⁵HDM alerjeni kullanan ve yanıt verenler, HDM uyarımı üzerine %38'den fazla degranülasyon sergileyenler olarak tanımlandı. Plazmadaki kortizol ölçümleri, üreticinin tavsiyeleri doğrultusunda ELISA kiti (Abcam) kullanılarak yapıldı.

İstatistikler

İstatistiksel testler Prism 8 yazılımı (GraphPad yazılımı v.10.4.2) ile yapıldı. Dunn düzeltmesini kullanan çoklu karşılaştırmalar için Kruskal-Wallis testi, Šidák düzeltmelerini kullanan çoklu karşılaştırmalar için iki yönlü ANOVA, Fisher'in kesin testi ve Mann-Whitney senİlgili şekil açıklamalarında belirtildiği gibi örnekler üzerinde testler yapılmıştır. Tüm istatistiksel testler iki taraflıydı. A P0,05'in altındaki değer istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Raporlama özeti

Araştırma tasarımına ilişkin daha fazla bilgi şu adreste mevcuttur:Doğa Portföyü Raporlama Özeti bu makaleye bağlı.