Hominin iki ayaklılığının evrimi iki adımda

Örnek toplama

E45-E72 insan gelişim aşamaları, Washington Üniversitesi'ndeki Doğum Kusurları Araştırma Laboratuvarı'nda (BDRL; Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) ödül numarası 5R24HD000836 tarafından desteklenmektedir) yürütülen ilk üç aylık dönem sonlandırma prosedürlerinden elde edilmiştir. İşlemlerden önce BDRL tarafından bağışçılardan onay alındı. Tüm protokoller NIH tarafından belirlenen etik yönergeleri takip etti. Washington Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulları (IRB'ler), araştırma için dokuların toplanmasını ve dağıtımını onayladı ve araştırma amacıyla örneklerin alınması ve kullanılmasına ilişkin izin, Harvard Üniversitesi'nin IRB'sinden (IRB16-1504) ve Mikrobiyolojik Güvenlik Komitesi'nden (COMS) (18-103) alındı. Daha sonraki aşamada (27 haftaya kadar) insan numuneleri, Great Ormond Street Çocuk Hastanesi NHS Foundation Trust'tan (GOSH) tamamen anonimleştirilmiş ölüm sonrası görüntüleme verilerinin dijital aktarımı yoluyla alındı. İşlem gününde BDRL'den alınan taze numuneler Hanks solüsyonunda (pH 6,8-7,3) yıkandı ve gece boyunca buz üzerinde gönderildi. Laboratuvara vardıklarında numuneler %5 FBS/DMEM ile doldurulmuş bir petri kabında parçalara ayrıldı ve eksiksiz olup olmadığı hızla incelendi. Her aşamadan üç ila dört örnek (E45, E53/54, E57, E59, E67 ve E72) önceki çalışmalarla uyumlu olarak analiz edildi¹⁹ (bkz. Ek Tablo 1 örnek ayrıntılar için). Daha sonra numuneler morfolojik (histoloji veya bilgisayarlı tomografi (BT) taraması) veya genetik çalışmalar (multiomik ve uzaysal transkriptomik) için kullanıldı ve ilgili bölümlerde açıklandığı gibi sabitlendi veya donduruldu.

Fare (M. kas) E15.5, E16.5 ve E18.5, Harvard Üniversitesi'ndeki Capellini laboratuvarında barındırılan yabani tip C57BL/6 NJ fare soyundan elde edildi. Fareler, etik kurallara uygun olarak 5 dakika boyunca karbondioksite maruz bırakılarak ötenazi uygulandı. Numuneler daha sonra buz soğukluğunda 1x PBS içerisinde bir mikroskop altında parçalara ayrıldı ve histoloji veya CT taraması için kullanıldı (ek ayrıntılar aşağıdadır).

Morfolojik analiz

İnsan ve fare örneklerinin histolojisi

Pelvik kuşak (hem sol hem de sağ taraf) ve çevredeki yumuşak dokular ışık mikroskobu altında disseke edildi. Sol pelvis Bouin fiksatifinde 24-48 saat süreyle sabitlendi. Numuneler daha sonra 1 x PBS'de yıkandı (3 kez, yıkama başına 30 dakika), bir etanol serisi kullanılarak kurutuldu ve her gelişim aşaması için farklı yönlerde (enine, sagittal ve koronal) paraplasta gömüldü (bkz. Ek Tablo) 1 örnek ayrıntıları, yerleştirme yönleri ve kopya sayısı için). Paraplasta gömülmüş numuneler, bir mikrotom kullanılarak 10 um'de seri olarak kesildi ve boyamaya kadar oda sıcaklığında saklandı. Boyama prosedürü değiştirilmiş bir Mallory trikrom protokolünü takip etti⁵⁷: 10 dakikalık bir hematoksilin lekesini Mallory I, fosfomolibdik asit, Mallory II, dehidrasyon ve ksilen bazlı şeffaf bir montaj içine yerleştirme takip etti. Lekeli slaytlar ayrı slayt kutularında saklandı (Ek Tablo 1). Trikrom lekesi kollajen ve kıkırdağı parlak mavi renkte vurgular; kırmızı kas; turuncu renkte keratin, koyu kahverengi renkte çekirdekler ve çevreleyen hücre dışı matris ve kırmızı renkte kan damarları.

Histolojik slaytların fotoğraflanması

İnsan ve fare pelvik kuşak örneklerinin histolojik toplanması, ayrı örneklerin üç düzlemde kesitlere ayrıldığı kapsamlı bir slayt arşiviyle sonuçlandı: enine, sagittal ve koronal. Her slayt 5-6 parafin bölümü içeriyordu ve bu da belgelendirme gerektiren toplam 1.500'den fazla bölüme yol açtı (Ek Tablo) 1). Bu slaytların fotoğrafını kolaylaştırmak için Harvard Biyolojik Görüntüleme Merkezi'ndeki ZEISS Axioscan 7 kullanıldı ve 125'e kadar slaytın eş zamanlı görüntülenmesine olanak sağlandı. Analizden önce doku kenar boşluklarını otomatik olarak tespit etmek ve tanımlamak için özel bir akıllı profil oluşturuldu. Daha sonra görüntüleri daha ileri analiz için ayrı ayrı içe aktarmak üzere ZEISS Blue yazılımı kullanıldı. 100 yıllık bir slayt serisi (H&E lekeli) Mikrosebus mioksinus New York'taki Amerikan Doğa Tarihi Müzesi'nden ödünç alınmıştır. Histolojik kesitler, gelişimsel bir seride (12 mm'den 18 mm'ye kadar değişen örneklerle) pelvik kuşak morfolojisini vurgulayanları belirlemek için dikkatlice incelendi. 100 yıllık slaytlar Axioscan ile uyumlu değildi; bu nedenle, bu paha biçilmez slaytlar, Cambridge'deki Karşılaştırmalı Zooloji Müzesi'nde (MCZ) bulunan bir TissueScope (LE 120) kullanılarak özel yapım slayt tepsileri (Ek Tablo) kullanılarak fotoğraflandı. 1 ek ayrıntılar için). Gelişimsel bir dizi Saguinus oedipus geoffroyi MCZ'de bulunan veriler de karşılaştırmalı veri setine eklendi. Yüksek çözünürlüklü slayt fotoğrafları, MCZ web sitesinde özel koleksiyonlar altında mevcuttur (Karşılaştırmalı Zooloji Müzesi, Harvard Üniversitesi, Harvard College Başkanı ve Üyeleri; lisans: https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/).

Gelişimsel numunelerin CT taraması

Gelişimsel numuneler (histolojik analiz için kullanılmayan disseke sağ veya sol taraflar) %4 PFA'da sabitlendi^58,59 4°C'de gece boyunca kurutuldu, metanol içinde kurutuldu ve ardından toplama tüplerinin dibine batıncaya kadar sırasıyla %20 ve %30 sakkaroza aktarıldı. Daha sonra numuneler 1 hafta boyunca 1x PBS içerisinde %3-5 fosfomolibdik asit ile boyandı. Bu sürenin sonunda numunelerde aşırı lekelenme görülmesi durumunda fazla lekenin giderilmesi için distile su ile durulandı. Numuneler daha sonra UChicago PaleoCT tarayıcı (GE Phoenix v/tome/x 240 kV/180 kV tarayıcı) kullanılarak tarandı. Tarama parametreleri Ek Tabloda verilmiştir 1.

Primat örneklerinin CT taraması

12 primat cinsini temsil eden otuz dört gelişimsel örnek, Chicago Doğa Tarihi Müzesi aracılığıyla μCT tarama görüntülemesi için seçildi (bkz. Ek Tablo). 1 örneklerin listesi ve ilgili tarama parametreleri için). Müze örnekleri genellikle yıllarca aynı çözelti içinde saklandığından, seçilen örnekler, dokuları tazelemek için 7 gün boyunca deiyonize su içinde yeni hazırlanmış %70 etanol içeren bir çözeltiye yerleştirildi. Bundan sonra numuneler, %70 etanolde seyreltilmiş %10'luk bir iyot çözeltisine (iyot (Sigma 207772) ve potasyum iyodürün (Sigma 221945) 1:2 oranında karıştırılmasıyla hazırlanmıştır) aktarıldı.^60,61. Numuneler, boyutlarına bağlı olarak üç ila on hafta boyunca bu çözeltide kaldı.

Örneklerin X-ışını bilgisayarlı mikrotomografik (μCT) taraması, Chicago Üniversitesi Organizma Biyolojisi ve Anatomi Bölümündeki PaleoCT Tarayıcı Tesisinde gerçekleştirildi (https://oba.bsd.uchicago.edu/node/261), 180 kV nano odaklı ve yüksek güçlü 240 kV mikro odaklı CT tüpüyle donatılmış bir Phoenix v|tome|x tarayıcı kullanarak.

Şempanze örneklerinin CT taraması

Tarihsel olarak 100-200 yaşında olduğu tahmin edilen iki şempanze örneği, Almanya Doğa Tarihi Müzesi'nden elde edildi. Bu örneklerin nadirliği ve değeri nedeniyle lekelenme önlendi ve örnekler orijinal kavanozlarında tarandı. Tarama parametreleri Ek Tabloda verilmiştir 1.

CT taramalarının segmentasyonu

Pelvik kuşakla ilişkili kemik, kıkırdak, kas ve kan damarlarının segmentasyonu için insan, fare ve primat örneklerinin taramaları Amira'ya (v.2022.1) aktarıldı. İlgilenilen her yapı ayrı bir malzeme olarak atandı. Daha sonra hacimler, karşılaştırmalı analiz için.stl dosyaları olarak dışa aktarılan morfolojik ağlar oluşturmak için seçilen malzemelere göre çıkarıldı.

10X Multiomik ve Visium uzaysal transkriptomik

İnsan doku örnekleri BDRL'den elde edildi. Daha sonra numuneler 1x PBS ve %5 FBS/DMEM'de durulandı. Aşağıdaki aşamaların her birinden 1-2 örneği analiz ettik: E45, E53/54, E57, E59, E67 ve E72. Her zaman noktasında, numunenin sol ve sağ tarafları mikroskop altında parçalara ayrıldı ve sırasıyla 10X Multiomik ve 10X uzamsal transkriptomik için kullanıldı (bkz. Ek Tablo) 1 örnek ayrıntılar ve Genişletilmiş Veriler için Şek. 2 Deneysel kurulum için). Sağ taraf hemen gömüldü ve OCT bileşiği içinde anında donduruldu. Doku blokları -80 °C'de saklandı. Sol taraf mikroskop altında disseke edilerek ilium ve yumuşak dokular ayrıldı. İlium dokuları %0,25 tip I kollajenazda (Corning) 37 °C'de 2 saate kadar sindirildi. Hücreler parçalandı ve çekirdekler, Tek Hücreli Multiomikler için Çekirdek İzolasyonu ATAC + Gen İfade Sıralaması protokolünde ayrıntılı olarak açıklanan üretici talimatları izlenerek izole edildi. Dokuların lizis süresi gelişim aşamasına göre değişiyordu: E53/54, 5 dakika; E57, 7 dakika; E67, 8 dakika; E72, 9 dk. Tek hücreli ATAC-seq ve RNA-dizileme kütüphaneleri, 10X Chromium Single Cell Multiome ATAC + Gen Expression kitine göre hazırlandı. Hedeflenen çekirdek kurtarma, gelişim aşamaları için 4.000-10.000 arasında değişiyordu. İzole edilmiş çekirdekler transpoze edildi, bir Chromium Next GEM çipine yüklendi; bu çip daha sonra çekirdeklere sahip bir GEl emülsiyon boncukları (GEM) oluşturmak için bir Chromium Kontrol Cihazı üzerinde çalıştırıldı. GEM inkübasyonu sonrası için çekirdekler, manyetik bir ayırıcı üzerinde Dynabeads ve SPRIselect kullanılarak temizlendi. GEM ile inkübe edilmiş çekirdekler daha sonra iki karışıma ayrıldı ve scRNA-seq ve scATAC-seq kütüphanelerini ayrı ayrı oluşturmak için aşağıdaki adımlar gerçekleştirildi: aktarılan parçalardan 10X barkodlu DNA üretildi ve tek hücreli RNA'dan 10X barkodlu cDNA üretildi. Kütüphaneler üreticilerin talimatlarına göre hazırlandı. Sıralama, Harvard Üniversitesi Bauer Core sıralama tesisinde bir NovSeq S2 platformu (1 şeritte 8 örnek), 100 bp çift uçlu okuma kullanılarak yapıldı.

Uzamsal transkriptomik için numuneler iliumun ve çevresindeki dokuların morfolojisini gösteren 8-10 bölüm titizlikle seçilerek sagittal ve enine kesitlere ayrıldı. Geriye kalan bölümler anatomik rehberlik amacıyla H&E ile boyandı. Her gelişim aşaması için geçirgenleştirme sürelerini belirlemek amacıyla deney protokolünden önce 10X Genomics optimizasyon slaytı ve reaktif kiti (PN-1000193) kullanılarak bir optimizasyon adımı gerçekleştirildi. Bu, LSM Zeiss 900 Konfokal mikroskop altında her aşama için floresan sinyalinin analiz edilmesiyle yapıldı: E45, 12 dakika; E54, 18 dakika; E57 ve E59, 20 dakika; E67, 22 dakika; E72, 24 dk. Optimizasyon süreleri belirlendikten sonra, taze dondurulmuş dokular için 10X Visium uzaysal transkriptomik kiti kullanılarak uzaysal transkriptomikler takip edildi. Her gen ekspresyon slaydı, 5.000 oligonükleotit barkodlu noktaya sahip dört yuvayla (her yuva 6,5 ​​mm x 6,5 mm yakalama alanıydı) donatıldı.

Flaşla dondurulmuş OCT doku blokları, kesitten önce -20 °C'de dengelendi. Kriyostat bıçağının sıcaklığı, uygun bölümleri elde etmek için optimize edildi (örneğin, insan pelvis kuşağı örnekleri için -18 °C). Her numuneden ilium morfolojisini gösteren 10 µM kalınlığındaki kesitler yakalama alanlarına yerleştirildi. Slaytlar her zaman kuru buz üzerinde tutuldu ve işlenene veya kesitten hemen sonra H&E ile boyanana kadar -80 °C'de saklandı. Boyalı bölümler Leica BF mikroskobu altında x10 büyütmede görüntülendi. Doku bölümleri, her aşama için belirlenen optimizasyon adımları izlenerek geçirgenleştirildi. Daha sonra ters transkripsiyon ve ikinci iplik sentezi gerçekleştirildi. cDNA ölçümü, bir Bio-Rad CFX96 gerçek zamanlı PCR makinesinde bir KAPA SYBR hızlı qPCR kiti kullanılarak kantitatif PCR (qPCR) kullanılarak gerçekleştirildi. Her yakalama alanı için cDNA amplifikasyon döngüleri, qPCR sonuçları kullanılarak hesaplandı (amplifikasyon döngüleri = Cq değerinin %25 tepe floresansı). Amplifiye cDNA, SPRI boncukları kullanılarak temizlendi ve cDNA'nın kalitesi ve miktarı, Agilent 4200 TapeStation High Sensitivity D5000 ScreenTape kullanılarak ölçüldü. Her numune için cDNA miktarı esas alınarak, sonraki Visium Spatial Gen ekspresyon kütüphanesi yapısı için numune indeksi PCR döngülerinin toplam sayısı hesaplandı. Kütüphaneler, SPRI boncukları kullanılarak çift taraflı bir seçim kullanılarak temizlendi. Adaptörler bağlandı ve SPRI boncukları kullanılarak son çift taraflı temizleme yapıldı. Oluşturulan kütüphanelerin kalitesi Agilent 4200 TapeStation High Sensitivity D5000 ScreenTape kullanılarak ölçülmüştür.

Kütüphane sonrası inşaatta, kütüphaneler KAPA-Illumina PCR ölçüm kiti kullanılarak ölçüldü, havuzlandı ve Harvard Üniversitesi Bauer çekirdeğindeki bir Illumina NovaSeq üzerinde sıralandı. Sekiz örnek tek şeritte çalıştırıldı ve üreticinin tavsiye ettiği derinliğe göre doku başına 100 bp okumaya göre sıralandı.

10X Genomik multiomik analizi

10X Genomics multiomik protokolü, veri toplama adımı sırasında işlenen her hücre için hem scRNA-seq hem de scATAC-seq verilerini üretti. Her ham FASTQ dosyasının kalitesi (hem scRNA-seq hem de scATAC-seq için) başlangıçta MultiQC (6.14) kullanılarak kontrol edildi. Tek hücreli multiomiklerden elde edilen hücre sayısı şu şekildedir: E53, 3.000–5.000; E57, 6.000–7.000; E59, 8.000; E67, 6.000; E72, 12.000 (Ek Tablo 1 aşama başına toplam hücre sayısını gösterir; Genişletilmiş Veri Şek. 4 tam hücre sayılarını ve kalite kontrol grafiklerini vurgular). Ham diziler, Cell Ranger yazılımı v.2.0.0 (10X Genomics tarafından geliştirilmiştir) kullanılarak GRCh38 insan genomu üzerine eşlendi. ScRNA-seq için Cell Ranger yazılımından elde edilen çıktı, iki farklı işlem hattı kullanılarak analiz edildi: (1) SCENIC+ analizi altında ayrıntılı olarak açıklanan Scanpy; ve (2) aşağıda açıklanan Seurat boru hattı.

Seurat v.4.3⁶² ve Signac v.1.10⁶³ sonraki analizler için kullanıldı. Mitokondriyal genoma eşlenen okumaların yüzdesini değerlendirmek için, 'MT-' ile başlayan genlere odaklanan PercentageFeatureSet işlevi kullanılarak mitokondriyal kalite kontrol ölçümleri hesaplandı. VlnPlot işlevi, benzersiz genlerin ve okumaların sayısını (toplam RNA dizilimi, ATAC dizilimi ve mitokondriyal yüzde) görselleştirmek için kullanıldı. Düşük kaliteli DNA'ya (düşük gen sayılarıyla kanıtlanmıştır), yüksek mitokondriyal DNA seviyelerine (hücre ölümünün göstergesi) veya anormal derecede yüksek gen sayılarına (hücre çiftlerini düşündürür) sahip hücreler, veri kalitesini sağlamak için analizin dışında bırakıldı.⁶⁴ (Genişletilmiş Veri Şek. 4 ve Ek Tablo 1). Veriler daha sonra sctransform (SCT tahlili yoluyla elde edilebilir) kullanılarak normalleştirildi. Daha sonra, oldukça değişken veriler üzerinde temel bileşenler analizi (ggplot2 kullanılarak görselleştirilmiş) gerçekleştirildi. Hücreler, Seurat'ta grafik tabanlı bir kümeleme yaklaşımı (doğrusal olmayan boyut azaltma tekniği) kullanılarak, benzer gen ekspresyon profillerine ve açık kromatin bölgelerine sahip hücreleri gruplayarak (0,8 çözünürlükte akıllı yerel algoritma (SLM) kullanılarak) kümelendi. Her aşamada her kümeye özgü genler, FindMarkers (Ek Tablo) işlevi kullanılarak kataloglandı. 2) ve farklı ifade modelleri, nokta grafikleri (DotPlot), özellik grafikleri (FeaturePlot), keman grafikleri (VlnPlot) ve ısı haritaları (DoHeatmap) (Genişletilmiş Veri Şekil 1) kullanılarak görselleştirildi. 4Ek Tablo 2 ve Ek Şekil. 2). Seurat analizinde tanımlanan her bir gen için transkripsiyonel aktivite, ilgilenilen genlerin yukarı akışındaki (±2 kb) ATAC-seq sayımlarının hesaplanmasıyla değerlendirildi. UMAP'ler ayrıca yalnızca scATAC-seq verileri kullanılarak üretildi (Genişletilmiş Veri Şekil 1). 4). ScRNA-seq veri kümesindeki ek açıklamalar, scATAC-seq verilerine aktarıldığında çapa görevi gördü. WNN kullanılarak, her hücreye birden fazla yöntem (RNA-seq ve ATAC-seq) entegre edildi ve yeni UMAP'ler üretildi (Ek Şekil 1). 1). Bu WNN UMAP'ler daha sonra sonraki analizlerde kullanıldı.

SCENIC+ analizi

Kondrositler, osteoblastlar ve erken perikondriyumdaki altta yatan GRN'leri anlamak için, tek hücreli gen ekspresyon verileri, tek hücreli açık kromatin bölgeleri ve transkripsiyon faktörü motifi zenginleştirme puanları, SCENIC+ kullanılarak eRegulon'ları (geliştirici odaklı GRN'ler) tahmin etmek üzere birleştirildi.⁶⁵ (Ek Şek. 6). SCENIC+'ı çalıştırmadan önce dört Python paketi kullanıldı: scanpy⁶⁶pycisKonu⁶⁷pycisHedefi⁶⁵ ve create_cis_Target_databases.

scRNA-seq verilerinin ön işlenmesi

Cell Ranger'dan elde edilen çıktı bir AnnData nesnesi olarak okundu. Kalite kontrolü için, 200'den fazla gen ifade eden hücreler ve 3'ten fazla hücrede ifade edilen genler, sonraki analizler için tutuldu. Çiftler Scrublet kullanılarak filtrelendi⁶⁸. Veri kalitesini artırmak için mitokondriyal okumalar kaldırıldı. SCENIC+ analizi için normalleştirme adımını atlayarak ham veri matrisi (adata.raw olarak) kullanıldı. Önceki Seurat analizinden elde edilen hücre tipi açıklamaları, kümeleri etiketlemek için bir referans olarak kullanıldı ve sonraki tüm analizlerde küme tanımlamasında ve işaretleyici genlerde tutarlılık sağlandı. Önceden işlenmiş scRNA-seq verileri daha sonra SCENIC+'a aktarılmak üzere bir.h5ad dosyası olarak kaydedildi.

ScATAC-seq verilerinin ön işlenmesi

PycisTopic, hücreleri ve erişilebilir bölgeleri düzenleyici konular halinde kümelemek ve önceki tek hücreli multiomik veri hücresi açıklamalarına dayalı olarak her hücre türü için sahte toplu profiller oluşturmak için kullanıldı. Her bir sahte toplu profil için, MACS2 kullanılarak fikir birliği zirveleri çıkarıldı.⁶⁹her hücre tipi için daha sonra ileri analizlerde kullanılan.bed dosyalarını üretti. Zirveler, fikir birliği zirve kümeleriyle birleştirildi. Her hücre için, hücre barkodu başına benzersiz parçaların log sayısı, hücre barkodu başına transkripsiyon başlangıç ​​bölgesi zenginleştirmesi ve hücre barkodu başına çoğaltma oranı hesaplandı. Bu kalite kontrol ölçümlerine dayanarak, kalite kontrol kontrolünü geçemeyen barkodlar filtrelendi ve yalnızca kalite kontrolü geçenler sonraki analizler için tutuldu.

cisTopic nesnesini oluşturma

Daha sonra meta verilerle (örneğin her hücrenin açıklamaları) bir cisTopic nesnesi oluşturuldu ve optimum sayıda konuya sahip bir model seçildi. Daha sonra, her hücre tipi için diferansiyel olarak erişilebilen bölgeler hesaplandı. Diferansiyel olarak erişilebilen bölgeler, sonraki SCENIC+ analizinde hücre tipi başına aday güçlendiricileri çıkarmak için kullanıldı. İnsanlara yönelik halihazırda mevcut bir CisTarget veritabanı (hg38) indirildi (https://resources.aertslab.org/cistarget/databases/homo_sapiens/hg38/screen/mc_v10_clust/region_ Based/).

Son olarak, SCENIC+ kullanılarak, scRNA-seq verilerimizden tanımlanan gen ekspresyon modelleri, PycisTopic analizinden erişilebilirlik zirveleri ve bölge setleri ve CisTarget insan veri tabanından transkripsiyon faktörü bağlanma bölgeleri, potansiyel güçlendirici odaklı GRN'leri (eGRN'ler) tanımlamak için bir araya getirildi. Açıklandığı gibi eRegulon'ları tanımlamak için gen seti zenginleştirme analizleri yapıldı.⁶⁵. Sonraki SCENIC+ analizi, eRegulon'ları ondan fazla hedefle tutarak varsayılan parametreler kullanılarak gerçekleştirildi. Her eRegulon için zenginleştirme puanlarını (eğrinin altındaki alan) hesaplamak için AUCell algoritması kullanıldı. eRegulon'ları on veya daha fazla hedefle tuttuktan sonra analizimiz, öncelikle kondrosit popülasyonlarına, mezenkimal hücrelere, perikondral ve osteoblast hücrelerine odaklanarak E53 ve E57'deki (eRSS puanlarına göre) her hücre tipi için ilk üç eRegulonu ortaya çıkardı (Ek Tablo) 7 ve Ek Şekil. 6).

eGRN'lerin oluşturulması

SCENIC+ analizinden oluşturulan transkripsiyon faktörleri (eRegulons) ve zenginleştirilmiş motiflere sahip hedeflenen genlerle birlikte düzenleyici ağ çıktısı Cytoscape'e aktarıldı⁷⁰ görselleştirme için (Ek Şekil 1). 4) ve daha fazla analiz. .csv dosyaları (Ek Tablo 7Transkripsiyon faktörlerini içeren) tahmin edilen hedef genleri ve ilişkili eRegulon puanları, Cytoscape'te ağ tabloları olarak formatlandı ve yüklendi. Hedef genler üçlü sıralamalarına göre sıralandı⁶⁵; en düşük sıralamaya sahip genlerin (yüksek üçlü sıralama değerleri), ilgilenilen eRegulon ile daha güçlü etkileşimlere sahip olduğu kabul edildi. eGRN'ler, hücre tipleri arasındaki temel ağları görselleştirmek amacıyla E53 ve E57'deki bireysel hücre tipleri ve ayrıca birleşik kondrosit popülasyonları için üretildi.

Görselleştirmeyi geliştirmek için, transkripsiyon faktörlerini temsil eden düğümler, eRegulon ilişkilerine göre renk kodluyken, hedeflenen genler, daha iyi netlik için farklı dairesel düğüm şekilleriyle görüntülendi. Kenarlar, SCENIC+ analizinden elde edilen güven puanlarına göre ağırlıklandırılarak düzenleyici etkileşimlerin gücüne ilişkin bilgiler sağlandı.

Hedeflenen tüm genler için GO zenginleştirme analizi yapıldı ve sonuçlar eGRN'lere yerleştirildi. Yeşil renkle vurgulanan, insan pelvik kuşağının anormalliklerinde daha önce yer alan genlere özel önem verilmiştir (bkz. Ek Tablo). 7 GO şartları için, P her aşama için değerler ve açıklamalar). Ortaya çıkan ağ görselleştirmeleri, anahtar transkripsiyonel düzenleyicilerin ve bunların aşağı yöndeki hedeflerinin tanımlanmasını sağlayarak hücre tipine özgü düzenleyici programların ve kondrosit popülasyonları arasındaki etkileşimlerin yorumlanmasını kolaylaştırdı.

10X Genomics Visium uzaysal transkriptomik analiz

ScRNA-seq verileriyle entegrasyon

Uzamsal transkriptomik analiz için sıralanan her morfolojik bölüm, kalitesi daha önce olduğu gibi MultiQC (v.1.14) kullanılarak kontrol edilen ham FASTQ dosyaları üretti.⁷¹. Diziler, Space Ranger (v.2.1.0) kullanılarak GRCh38 insan genomu üzerine eşlendi. Veriler, tek hücreli multiomik verilere benzer şekilde önceden işlendi ve sctransform kullanılarak normalleştirildi. Daha sonra Seurat v.4.3, Space Ranger çıktılarını analiz etmek ve her histomorfolojik bölüm için UMAP'ler oluşturmak için kullanıldı. Her anatomik konum için tek hücreli verilerden tanımlanan işaretleyici genler, SpatialFeaturePlot işlevi kullanılarak görselleştirildi. Visium uzamsal veri setinin çözünürlüğünü arttırmak için, uzamsal veriler, hücre kümesi ekspresyon modellerini görselleştirmek için (önceden işlenmiş scRNA-seq verilerinin bir sabitleme referansı olarak görev yaptığı) aşamayla eşleşen tek hücreli multiomik verilerle (Ek Şekil 1) entegre edildi. 1). Doku kesitlerinde önemli ölçüde ifade edilen genleri tanımlamak amacıyla her noktada ifade edilen her gen için genelleştirilmiş bir doğrusal negatif binom modeli uyguladık. Space Ranger çıktısı aynı zamanda her histolojik bölümde gen ifadesini görselleştirmek için Büyüteç Tarayıcısında (v.8.0.0) daha fazla işlenen bir CLOUPE dosyası da oluşturdu.

CellChat analizi

Dış hücre popülasyonları (E45'teki mezenkimal hücre popülasyonu ve E53'teki perikondriyum) ile E45 ve E53'teki uzaysal transkriptomik bölümlerdeki iç kıkırdak modeli arasındaki iletişime aracılık eden potansiyel sinyal yollarını araştırmak için CellChat'i kullandık.⁷². CellChat, uzaysal olarak çözülmüş transkriptomik verilerden ligand-reseptör etkileşimlerini anlamak için kullanıldı ve ilgilenilen dokulardaki anahtar sinyal ağlarının tanımlanmasına olanak sağladı. Bu analiz için, önceki uzamsal ve seurat analizinden elde edilen hücre tipi açıklamalar, farklı popülasyonları tanımlamak üzere entegre edildi. Ligand-reseptör etkileşimleri, ifade edilen genlerin CellChat veri tabanından (CellChatDB) bilinen sinyal çiftleriyle eşleştirilmesiyle tahmin edildi. Burada hücre-hücre iletişimini görselleştirmek için CellChatDB'nin 'Gizli Sinyalleme' alt kümesi kullanıldı. Biyolojik olarak ilgili etkileşimleri önceliklendirmek için, defineOverExpressedGenes ve defineOverExpressedInteractions işlevlerini kullanarak, iç kıkırdak modeline yönelik öngörülen sinyalleşme aktivitesini gösteren, harici hücre popülasyonlarında zenginleştirilmiş yollara odaklandık. Daha sonra, her hücre için ortalama gen ekspresyonu hesaplandı (truncatedMean kullanılarak). Düşük etkileşim sayısına sahip hücreler filtrelendi. Kıkırdak gelişimi, hücre dışı matrisin yeniden şekillenmesi ve hücresel çoğalma ile ilişkili anahtar yollar vurgulanmıştır (Ek Şekil 1). 3). Tahmin edilen sinyalleşme ağlarını görselleştirmek için, hücreler arası iletişimin yönünü ve gücünü gösteren akor grafikleri, ısı haritaları ve hiyerarşik grafikler oluşturduk. Bu akor ve etkileşim grafikleri, uzaysal profil boyunca hücre-hücre etkileşimlerinin hiyerarşik bir görünümünü oluşturmak için (netVisual_aggregate fonksiyonunu kullanarak) uzaysal transkriptomik profillere eşlendi. Sonuçlar, kıkırdaklı modelin geliştirilmesini ve sürdürülmesini etkileyebilecek potansiyel sinyal ağlarına ilişkin bilgiler sağladı. Ligand-reseptör etkileşimlerine daha büyük ölçekte daha derinlemesine bakmak için her multiomik örnek için de benzer analizler yapıldı. Bununla birlikte, kısaca belirtmek gerekirse, yalnızca erken uzamsal transkriptomik verilerimize odaklandık (Ek Şekil 1). 3).

İçsel (iç) ve dışsal (dışsal) analiz

Her bölüm (E45 ve E53'te), iliumun ön-arka genişlemesi sırasında dış ve iç hücre popülasyonları (dış ve iç ipuçları) arasında farklı şekilde ifade edilen genleri ayırt etmek için Büyüteç Tarayıcısında yeniden kümelendi (bkz. Ek Not).2). Seurat boru hattı kullanılarak gerçekleştirilen ilk kümeleme yalnızca 5-7 küme tanımladı (Ek Şekil 1). 1). Bu nedenle yeniden kümeleme adımı, diferansiyel olarak ifade edilen genlere dayalı hücre kümelerini daha da geliştirdi. Hem E45 hem de E53 için beş ila altı bölüm seçildi (Genişletilmiş Veri Şekil 1). 6) ve ilgi duyulan bölgeleri tanımlamak için serbest el aracı kullanıldı. Dahili ipuçları için yalnızca kıkırdak anlajeni kaplayan noktalar seçilirken, dışsal analiz için hem kıkırdak hem de bitişik yumuşak dokuları kaplayan noktalar dahil edildi. Her bölüm, ilgi bölgelerindeki alt kümeleri tanımlamak için yeniden analiz edildi (bkz. Ek Tablolar) 3 Ve 4 tüm alt kümeler ve genleri hakkında ayrıntılı bilgi için). Her alt kümedeki hem iç hem de dış ipuçlarından elde edilen ilk 300 gen, günlüklerine göre incelendi₂-dönüştürülmüş kat değişimi ve P değerler. İfade kalıpları, ilgilenilen her bölümde manuel olarak görselleştirildi. Her kümedeki en üst genler için pelvik kuşak morfolojisi, hücre göçü, hücre proliferasyonu ve hücre bölünmesi ile bağlantılı genleri tanımlayan kapsamlı bir GO analizi yapıldı (Ek Tablolar) 3 Ve 4). Bu rafine edilmiş gen listesinden ilgilenilen popülasyonlar belirlendi: E45 dış mezenkimal popülasyonu ve dahili iliak kondrosit popülasyonu ve E53 dış perikondral hücreler ve dahili kondrosit popülasyonu. İlgilenilen genler, potansiyel önem taşıyan bölgeleri belirlemek için UCSC Genom Tarayıcısı kullanılarak daha da analiz edildi (Ek Not)2).

Temel evrimsel sinyallerin şifresini çözmek ve zenginleştirme tahlili

MACS2 analizinden elde edilen konsensüs zirve dosyaları (önceki SCENIC+ analizinde açıklanmıştır) evrimsel sinyalleri araştırmak için kullanıldı. Çeşitli gelişim aşamalarında tanımlanan her hücre tipi için ayrı BED dosyaları HAR'lar, HAQER'ler ve hCONDEL'lerle örtüştü (Ek Not)2) Bedtools v.2.31.0 kullanılarak (Ek Tablo) 5). Farklı gelişim zaman noktalarında bu hücre tipine özgü zirve kümeleri içindeki HAR'ların zenginleşmesini sistematik olarak değerlendirmek için, rastgele örneklenmiş genomik arka planlara göre zenginleştirme analizleri yapıldı. Spesifik olarak, zenginleşmenin önemi, kat zenginleşmeleri ve ilgili P değerler ile P değerler daha sonra Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranı (FDR) düzeltme yöntemi kullanılarak tüm gelişim aşamalarında ayarlandı (sonuçlar Ek Tabloda ayrıntılı olarak açıklanmıştır) 5). Önemli derecede zenginleşme gösteren zirveler sıkı eşiklere göre tanımlandı: düzeltildi P değerler 0,05'ten küçüktür ve kat zenginleştirme değerleri, rastgele şansla beklenen değerleri önemli ölçüde aşar (kat >1,5). Zaman noktası içi karşılaştırmalı zenginleştirme analizleri için ampirik arka plan dağılımları oluşturmak amacıyla 10.000 rastgele karıştırmayı içeren sıkı bir permütasyon stratejisi uygulandı. Karıştırılan her arka plan, test edilen hücre tipine özgü set içindeki tepe noktalarının medyan boyutuna ve toplam tepe sayısına tam olarak eşleştirildi. Bu, gözlemlenen HAR örtüşmelerinin karşılaştırılabileceği sağlam bir istatistiksel temel sağladı. Ayrıca, belirli hücre tiplerinin, aynı gelişim aşamasında birlikte ortaya çıkan diğer hücre tiplerine göre HAR'lar açısından tercihli zenginleşme sergileyip sergilemediğini spesifik olarak test etmek için, havuzlanmış bir tepe arka planı oluşturuldu. Bu havuzlanmış set, incelenmekte olan hedef hücre tipinin pikleri hariç olmak üzere, belirli bir aşamadaki tüm hücre tiplerinden pikleri içermekteydi. Bu hariç tutma stratejisi, sıkı bir karşılaştırmalı arka plan sağladı, yüksek aktiviteli bölgelerden gelen önyargıyı azalttı ve böylece zenginleşme tespitinin özgüllüğünü güçlendirdi. Bu ikili arka plan yaklaşımını kullanarak, hem geniş genomik hem de katı zaman noktası içi karşılaştırmalı arka planlardan yararlanan analizler, gerçek evrimsel zenginleşme sinyallerini arka plan gürültüsünden güçlü bir şekilde ayırt etti. Bu kapsamlı ve titiz strateji, HAR'lar açısından önemli ölçüde zenginleştirilmiş hücre tiplerinin kesin olarak tanımlanmasını sağladı.

HARİKA analiz

MACS2 analizinden tanımlanan scATAC-seq zirveleri (E53, E57, E67 ve E72'deki kondrosit, mezodermal, perikondral ve osteoblast hücreleri için) ile ilişkili genomik bölgelerin biyolojik önemini incelemek için, Ek Açıklama Aracının Genomik Bölgeleri Zenginleştirme Aracı (GREAT) analizini gerçekleştirdik⁷³. Güçlü zenginleştirme sonuçları elde etmek için analizi iki farklı arka plan seti kullanarak gerçekleştirdik: özel olarak oluşturulmuş bir arka plan ve tüm genom arka planı. Özel arka plan, ilgilenilen zirvelerin boyutu ve dağıtım özellikleriyle (sonuçlanan tüm zirvelerle birleştirilmiş bir veri seti) eşleşen genomik bölgeler üretilerek oluşturuldu ve daha hassas zenginleştirme analizi için özel bir referans seti sağlandı. Buna paralel olarak, fonksiyonel zenginleşmeyi değerlendirmek için daha geniş bir bağlam sağlamak amacıyla tüm genom arka planı kullanıldı. Her iki analiz de, transkripsiyon başlangıç ​​bölgesine yakınlığa ve düzenleyici alan uzatma kriterlerine göre genomik bölgeleri genlere atayan varsayılan birliktelik kuralı kullanılarak gerçekleştirildi. GO, biyolojik yollar ve dokuya özgü düzenleyici unsurlar dahil olmak üzere fonksiyonel zenginleştirme terimleri, tanımlanan zirvelerle bağlantılı potansiyel biyolojik süreçleri tanımlamak için incelendi (bkz. Ek Tablo) 6 daha fazla ayrıntı için).

Hücre soyu izleme analizi

Velocyto (v.0.17)⁷⁴ Cell Ranger aracılığıyla üretilen 10X Genomics multiomik çıktı dosyalarından başlangıç.loom dosyasını (her aşama için scRNA-seq verilerini depolamak için bir format) oluşturmak için kullanıldı. Burada run10X işlevi, GRCh38 insan genomu ve karşılık gelen açıklama dosyasıyla birlikte.loom çıktı dosyasını oluşturmak için kullanıldı. Velocyto'dan gelen bu çıktı dosyası, her gelişim aşaması için Seurat'tan gelen hücre açıklamaları ve UMAP'lerle birlikte scVelo (Python ortamında v.0.24) için girdi dosyaları olarak görev yaptı.⁷⁵ RNA hız grafikleri oluşturmak için^75,76 (İncir. 4a). RNA hızı, bir hücrenin gen ifadesinin zaman ve mekan içinde görselleştirilmesine yönelik öngörücü bir yöntemdir. Toplam boyuta göre normalleştirmeyi içeren RNA verilerinin ön işlenmesiyle dinamik modelleme yaklaşımı uygulandı. Dinamik model için olabilirliğe dayalı beklenti maksimizasyon çerçevesi uygulandı. Eklenmiş (olgun hücreler) ve eklenmemiş (genç hücreler) sayıları, her hücrenin yörüngesini izlemek için scv.tl.velocity fonksiyonu kullanılarak hesaplandı. Yörünge analizi, Seurat analizinden (scv.pl.velocity_embedding_stream işlevi kullanılarak) UMAP'lere yerleştirildi ve scv.pl.velocity işleviyle görselleştirildi.

Hi-C analizi ve kromatin mimarisinin görselleştirilmesi

Kromatin organizasyonunu araştırmak ve topolojik olarak ilişkili alanları (TAD'ler) tanımlamak için Hi-C analizi gerçekleştirdik⁷⁷ kondrositler için kamuya açık verileri kullanma (NCBI Gen İfadesi Omnibus (GEO) erişimi) GSE200345). .hic dosyası Juicer boru hattı kullanılarak indirildi ve işlendi⁷⁸. Meyve Sıkacağı Kullanımı⁷⁸temas matrisleri oluşturuldu ve önemli 3D genom etkileşimlerine sahip bölgeleri tanımlamak için kromatin etkileşim döngüleri çağrıldı. TAD sınırları ve etkileşim sıcak noktaları dahil olmak üzere kromatin mimarisini görselleştirmek için, hücre tipine özgü tepe dosyalarıyla birlikte işlenmiş veriler Juicebox (Genişletilmiş Veri Şekil 1) kullanılarak görselleştirildi. 9). Bu, TAD yapılarının, etkileşim tepe noktalarının ve ilgilenilen genlerin yakınındaki kromatin sıkışma bölgelerinin net bir şekilde tanımlanmasını sağladı.

T410R Jansen fare hattı üretimi

HA etiketiyle (burada WT-PTH1R olarak anılacaktır) PTH1R eksprese eden farelerin üretilmesi daha önce tarif edilmiştir.⁷⁹. 410. pozisyondaki Thr'yi Arg ile değiştirmek için, daha önce özetlenen protokolü takip ederek, WT-PTH1R (C57BL6/CD1 karışık tür) için bir erkek homozigot ile çiftleştirilmiş olan vahşi tip dişilerde (CD1) çiftleşmeden yaklaşık 16 saat sonra oviduktal nükleik asitlerin verilmesi (i-GONAD) yoluyla iyileştirilmiş genom düzenlemesi gerçekleştirildi.⁸⁰.

Kısaca, dorso-lateral kesilerden yumurtalıklar ve yumurta kanalları cerrahi olarak açığa çıkarıldı. Her bir yumurta kanalının lümenine önceden karıştırılmış bir CRISPR genom düzenleme çözeltisinden 2 ul enjekte etmek için ucu konik bir cam kılcal pipet kullanıldı. Bu çözelti, 1,5 ul iki parçalı bir CRISPR kılavuz RNA (crRNA) (5′-GAAGCTGCTCAAATCCACGCTGG-3′) ve trans-30 μM (IDT) nihai konsantrasyonunda CIRSPR RNA'nın (tracrRNA) aktive edilmesi, 3 μg μl'de 75 nükleotidlik tek iplikli DNA onarım şablonunun 1,5 μl'si (5′-CACACGGCAGCAGTACCGGAAGCTGCTCAAATCTAGACTAGTGCTCATGCCCCTCTTTGGCGTCCACTACATTGT-3′)⁻¹ (IDT), T410R mutasyonunu ve üç sessiz nükleotid değişikliğini tanıtarak bir XbaI kısıtlama bölgesi oluşturdu, 1 ul rekombinant Cas9 (4 μg μl)⁻¹; IDT) ve 0,4 ul Fast Green boyası (0,1 mg ml⁻¹; Sigma-Aldrich). Enjeksiyonun hemen ardından yumurta kanalları, steril PBS ile ıslatılmış Kimwipe (Kimberly-Clark) ile kaplandı ve CUY652P2.5x4 (Nepa Gene) elektrot cımbızlı bir BTX-820 kare puls üreteci kullanılarak elektroporasyon gerçekleştirildi. Puls üreteci 0,5 cm elektrot aralığıyla 50 V, 5 ms, 8 pulsa ayarlandı. Yumurtalıklar ve yumurta kanalları daha sonra orijinal konumlarına döndürüldü ve kesiler dikildi. Genomu düzenlenmiş ve düzenlenmemiş embriyoların olgunlaşmasına izin verildi ve insan WT-PTH1R'ye mutasyon girişini doğrulamak için yavrulara genotip uygulandı.

i-GONAD yavrularından genomik DNA, kuyruktan (yaş 20 gün) izole edildi. PCR, ileri primer (5′-CTGTGACCCTTCTTCCTTTACTTCCT-3′) ve ters primer (5′-AGGTACAAGCTGAGATCAAGAAAT-3′) içeren 2 ul DNA kullanılarak gerçekleştirildi; Termodöngü koşulları şunlardı: 95 °C'de 5 dakika süreyle başlangıç ​​denatürasyonu, ardından 95 °C'de 15 saniye boyunca 35 döngü denatürasyon, 58 °C'de 10 saniye boyunca tavlama ve 72 °C'de 20 saniye boyunca uzatma ve 72 °C'de 10 dakika boyunca son uzatma. Jel elektroforezinden sonra (%1,6 agaroz Gel Green, Biotium 41005 ile boyandı), beklenen boyuttaki (567 bp) DNA bantları çıkarıldı, saflaştırıldı ve amplifikasyon primerleri kullanılarak Massachusetts Genel Hastanesi dizileme çekirdeğinde nükleotid dizi analizi için gönderildi. Bir XbaI kısıtlama bölgesi (TCTAGA) oluşturan sessiz mutasyonlar ve T410R mutasyonunu getiren C>G değişikliği dahil olmak üzere onarım şablonunun varlığını doğrulamak için PCR amplikonları, başka bir jel elektroforezinden önce XbaI (60 dakika, 35 °C) ile inkübe edildi. Beklenen bant boyutları mutant alel için 379 bp ve 188 bp, vahşi tip alel için ise 567 bp idi.

Farelerin LacZ boyaması

Varsayılan düzenleyici bölgenin aktivitesini gözlemlemek RUNX2ilgilenilen bölge (Hg38 chr. 6: 44917111–44919226) Hsp68'e klonlandı lacZ vektör. Aynı zamanda bu varsayılanın ortolog bölgesi kullanılarak benzer bir vektör yaratıldı. RUNX2 şempanze genomundaki güçlendirici (panTro6, Chr. 6: 44438191–44440307). Soy (E14.5'te) lacZ transgeni için genotiplendi ve her iki yapı için hem lacZ-pozitif (toplam 13) hem de lacZ-negatif fare numuneleri (toplam 12) daha sonra X-gal boyamaya tabi tutuldu. E14.5 numuneleri ilk önce 4 °C'de gece boyunca %4 PFA'da sabitlendi ve ardından fazla fiksatifin uzaklaştırılması için 1x PBS'de yıkandı. Daha sonra örnekler MgCl içeren yıkama tamponunda yıkandı.₂deoksikolat, NP-40 ve sodyum fosfat (pH 7,3). Daha sonra numuneleri tamamen kaplayacak şekilde X-gal boyama solüsyonu ilave edildi ve numuneler, renk oluşana kadar karanlık bir odada bırakıldı (Şekil 1). 4 gün). Numuneler mavi renk gösterdiğinde X-gal çıkarıldı ve ardından yıkama tamponunda yıkandı ve uzun süreli saklama için yeniden sabitlendi.

Katılım ve etik beyanı

Gelişimsel (E45-E72) insan kas-iskelet sistemi ve bitişik dokularından örnekler, etik kurul onayı ve annenin yazılı onamıyla Washington Üniversitesi'ndeki BDRL'den elde edildi. Bu çalışma, etik ve yasal yönergelere ve NIH tarafından oluşturulan etik yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi. Washington Üniversitesi IRB'leri, araştırma amacıyla insan dokularının toplanmasını ve dağıtılmasını onayladı ve araştırma amacıyla örneklerin alınması ve kullanılmasına ilişkin izin, Harvard Üniversitesi'nin IRB'sinden (Capellini: IRB16-1504) ve Mikrobiyolojik Güvenlik Komitesi'nden (COMS) (18-103) alındı. Tüm fare protokolleri Harvard Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve tüm fare çalışmaları Capellini laboratuvarı IACUC protokolü (13-04-161-3) kapsamında ele alındı.

Raporlama özeti

Araştırma tasarımına ilişkin daha fazla bilgi şu adreste mevcuttur:Doğa Portföyü Raporlama Özeti bu makaleye bağlı.