Koordineli bir hücresel ağ, gıdaya toleransı düzenler
Fareler
Fareler, Weizmann Enstitüsü'nün hayvan tesisinde, yaklaşık 18-23 ° C'de% 40-60 nem ve 12 saat -12 saatlik ışık-karanlık döngülerinde spesifik patojensiz koşullarda yetiştirildi ve korundu. C57BL/6 Fareler (Jackson Laboratuvarı (JAX) 000664), Itgav f/f fareler (b6.129p2 (cg) -itgav tm2hyn/j, jax 032297, CD45.1 fareler (b6.sjl-ptprca pepcb/boyj, jax 002014), I-AbFL/FL Fareler (B6.129 × 1-H2-AB1TM1KONI/J, JAX 013181), OT-II fareleri (B6.CG-TG (TCRATCRB) 425CBN/J, JAX 004194), OT-I fareleri (C57BL/6-TG (TCRATCRB) 1100/6-TG (TCRATCRB)/6-TG (TCRATCRB)/6-TG (TCRATCRB), CD90.1 fareleri (B6.PL-Thy1A/Cyj, Jax 000406), Tdtomato fareleri (B6.CG-GT (ROSA) 26Sortm14 (CAG-TDTOMATO) Hze/J, Jax 007914), ECFP) CK6NAGY/J, J3) CK6NAGY/J, J377777777914) (B6.129P2-GT (ROSA) 26Sortm1 (DTA) LKY/J, JAX 009669) ve FOXP3DTR Fareler (B6.129 (CG) -FOXP3TM3 (HBEGF/GFP) Ayr/J, Jax 016958) Jackson Laboratuvarı'ndan satın alındı. OrkCre fareler34 Dr Littman'ın Laboratuvarı, I-AB tarafından üretildiLox-Stop-Lox Fareler TM Laufer'in laboratuvarı tarafından üretildi35 Ve Clec9aCre fareler36 C. Reis e Sousa'nın laboratuvarı tarafından üretildi. XCR1Venüs Fareler A. Miyawaki'nin laboratuvarı tarafından üretildi37-38. XCR1CRE-MTFP1 Fareler B. Malissen laboratuvarı tarafından üretildi17. RoraCre Fareler D. O'Leary'nin laboratuvarında üretildi39. Eşleşen seks (hem erkekler hem de kadınlar) olan çöp arkadaşları kullanıldı. Tüm deneylerde fareler, tedavinin başlangıcında 6-12 haftalıktı. Hayvan örnek boyutu tahminleri güç analizi kullanılarak belirlendi (güç =% 90 ve A = 0.05) Grup başına dört ila beş hayvan kullanan önceki çalışmalarımızdan ve/veya pilot çalışmalarımızdan elde edilen verilerin ortalaması ve SD'sine dayanmaktadır. Tüm hayvan prosedürleri, Weizmann Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak yapıldı.
Antikorlar, hücre içi boyama ve akış sitometrisi
Aşağıdaki monoklonal antikorlar, eBiosciences, BD pharmingen veya biolegend'den satın alındı: phycoerythrin (PE)/siyanin5 granzim B (klon QA16A02), Alexa Fluor 700 Ia/IE (klon m5/114.15.2), fitc tcr vP5-4), fitc tcr vP.2 (klon mr9) β zinciri (klon H57-597), Parlak Violet 711 CD8B (LY-3) (LY-3), PE/Cyanine7 FR4 (folat reseptör 4) (klon 12A5), CD25 kıvılcım-nir 685 (klon PC618), CD71C PE-Cy7 (klon N418), CD7) Pe-Cy7 (klon N418), CD7) Ty/11.8), CD69 FITC (klon H1.2F3), KLRG1 PE-FIRE810 (klon 2F1/KLRG1), CD107A (LAMP-1) APC-CY7 (klon 1d4b), CD51 PE (klon RMV-7) AP7 (CD273, B7-DC), Klon TYP2 (CD273, B7-DC), K ve (Klon Zet).
Aşağıdaki monoklonal antikorlar BD Bioscience'dan satın alındı: PE-CF594 T-Bet (klon O4-46), RB705 CD80 (klon 16-10a1), CD45.1 BV650 (klon A20), CD11C Buv496 (klon M290), CD103 BV496 (klon M290), CD25, CD25, Clone, CD25) GATA3 Buv395 (klon L50-823), CD86 Buv661 (klon PO3), BCL-6 Buv805 (klon K112-91), CD4 APC-CY7 (klon GK1.5), CD45.2 Buv737 (klon Im7), CD44 percp-cy5.5 (klon Im7), CD44 percp-cy5.5 (klon 104), Q31-378), FOXP3 AF647 (klon R16-715), CD19 RB545 (klon 1D3), CD90.1 BV786 (klon OX-7), SIRPa (CD172A) Buv615 (klon p84 (klon p84), CD19) BV421 (klon CW2), CD199) BV421 (klon), CD19) BV421 (klon), cd19) BV421 (klon) (klon M1/70), CXCR6 (klon CD186) APC (klon SA051D1), CD62L BV421 (klon Mel-14), CLEC12A (CD371) PE (klon 5d3), T-Sekt H-2kb ova tetramer-siinfekl-pe (H-2k (B pe-2k (B pe-2k (B Pe) Siinfekl; NIH Tetramer Çekirdek Tesisi). I-AB APC Tavuk OVA (328-337) (Haahaeinea), I-Ab PE Tavuk OVA (329-337) (Aahaeinea). Ölü hücreleri hariç tutmak için canlı/ölü sabitlenebilir canlılık boyası 575V (BD Horizon) kullanıldı. Hücreler, tam ortamda 2 saat boyunca oda sıcaklığında I-AB tetramerleri ile boyandı. Transkripsiyon faktörü boyaması için hücreler yüzey markerleri için boyandı, ardından üreticinin protokolüne (EBIOScience'dan ayarlanan FOXP3 boyama tamponu) göre nükleer faktör boyamadan önce fiksasyon ve geçirgenleştirme izlendi. Akış sitomety verileri, spectroflo (v.3.03) kullanılarak bir Cytek aurora (Cytek) üzerinde elde edildi ve Flowjo V.10.8.1 yazılımı (Becton Dickinson) kullanılarak analiz edildi.
Akış sitometri geçitleme stratejisi
Bu bölüm, kullanılan geçitleme stratejilerini detaylandırmaktadır. OT-II geçidi için: İleri dağılım (FSC), yan saçılma (SSC); Canlı Ölü-singlets, çöplük- (CD19, MHCII), TCRβ+CD8-. CD4+VB5+CD45.1+ veya CD90.1+. OT-i geçit için: FSC, SSC; Canlı Ölü-singlets, çöplük- (CD19, MHCII), TCRβ+. CD4-CD8+VB5+CD45.1+ veya CD90.1+. I-Ab-OVA Gating için: FSC, SSC; Canlı Ölü-singlets, çöplük- (CD19, MHCII), TCRβ+. CD4+CD8-I-Ab-OVA+. H-2kb-OVA geçitleme için: FSC, SSC; Canlı Ölü-singlets, çöplük- (CD19, MHCII), TCRβ+. CD4-CD8+H-2KB-OVA+. Göçmen CDC1 geçit için: FSC, SSC; Canlı Ölü-singlets, çöplük- (CD19, TCRβ), CD11C+PDL2+Xcr1+SIRPa-. Göçmen CDC2 geçitleme için: FSC, SSC; Canlı Ölü-singlets, çöplük- (CD19, TCRβ), CD11C+PDL2+Xcr1-SIRPa+. Yerleşik CDC1 geçit için: FSC, SSC; Canlı Ölü-singlets, çöplük- (CD19, TCRβ), CD11CMERHABAPDL2-Xcr1+SIRPa-. Yerleşik CDC2 geçit için: FSC, SSC; Canlı Ölü-singlets, çöplük- (CD19, TCRβ), CD11CMERHABAPDL2-Xcr1-SIRPa+. ILC3 için: FSC, SSC; Canlı Ölü-singlets, çöplük- (CD19, TCRβ), Rorγt+Cxcr6+. Rorγt için+ APC'ler: FSC, SSC; Canlı Ölü-singlets, çöplük- (CD19, TCRβ), Rorγt+Cxcr6-. B hücreleri için: FSC, SSC; Canlı Ölü-singlets, çöplük- CD19+.
Lenfositlerin ve APC'lerin izolasyonu
Peyer yamalarının çıkarılmasından sonra, ince bağırsak dokuları, epitelyal hücreleri uzaklaştırmak için 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 mm ditiotreitol içeren PBS ile 10 dakika, iki kez 10 dakika boyunca 5 mM EDTA ile 37 ° C'de 5 mM EDTA ile muamele edildi. Dokular daha sonra kıyma ve sindirim tamponu (kollajenaz içeren RPMI (1 mg mL−1 kollajenaz D; Roche), DNase I (100 μg ml−1; Sigma), Dispase (0.1 u ml−1; Worthington) ve% 10 FBS) 55 dakika boyunca 37 ° C'de sabit karıştırma ile. Lökositler,% 40-80 Percoll gradyanının (GE Healthcare) arayüzünde toplandı. Lenf düğümleri lenfosit izolasyonu için mekanik olarak bozuldu. Miyeloid hücrelerin ve ILC'lerin izolasyonu için lenf düğümleri, 30 dakika boyunca 37 ° C'de sabit karıştırma ile sindirim tamponu ile mekanik olarak bozuldu.
OVA'nın oral yönetimi
OVA (Sınıf III, Sigma, A5378) plastik gava iğneleri kullanılarak intragastrik olarak uygulandı. Fareler, OT-II veya OT-I T hücrelerinin benimsenen transferinden 1 ve 2 gün sonra 200 ul PBS'de 50 mg ile gavalandı. Bazı deneylerde, belirtildiği gibi, fareler aynı anda içme suyunda (ağırlıkça% 1.5) çözünmüş OVA ile AD libitum ile beslendi.
İle enfeksiyon Listeria ve lmova
Enfeksiyon deneyleri için OVA eksprese edici (LMOVA)40 veya ebeveyn WT suşu 10403'ler kullanıldı. Fareler ağızdan 10 ile enfekte edildi9 OVA'nın oral uygulamasından 7 gün sonra LMOVA veya Listeria koloni oluşturan birimler.
OT-II ve OT-I TCR'nin evlat edinme transferiTg hücre
OT-II ve OT-I'in evlat edinme transferi daha önce tarif edildiği gibi yapıldı4küçük değişikliklerle. Donör OT-II ve OT-I TCR'den dalak ve lenf düğümleriTg Fareler toplandı ve mekanik olarak ayrıldı. Kırmızı kan hücreleri ACK lizis tamponu (Lonza) kullanılarak lize edildi. Saf OT-II T hücreleri CD4 olarak sıralandı+TCRβ+CD44loCD62LMERHABACD25-Vβ5+CD45.1+ veya CD4 olarak+TCRβ+CD44loCD62LMERHABACD25-Vβ5+CD90.1+. Saf OT-I T hücreleri CD8 olarak sıralandı+TCRβ+CD44loCD62LMERHABACD25-Vβ5+CD45.1+ veya CD8 olarak+TCRβ+CD44loCD62LMERHABACD25-Vβ5+CD90.1+ MA900 Çok Uygulama Hücre Sıra'da (Sony). Erken farklılaşmanın analizi için hücreler ayrıca hücre proliferasyonu V450 (BD Bioscience) ile etiketlendi. Hücreler buz üzerinde PBS içinde yeniden süspanse edildi ve 50.000-100.000 hücre daha sonra retro-orbital enjeksiyon ile konjenik izotip etiketli alıcı farelere aktarıldı. MLN'den gelen hücreler transferden 3 gün sonra analiz edildi ve SILP'den hücreler transferden 9-14 gün sonra analiz edildi.
BM-chimerik yeniden oluşturulmuş farelerin üretimi
Kimerik fareler üretmek için, 4 ila 5 haftalık MHCII'nin yeterli CD45.1 fareleri, fare başına 2-5 saatlik bir aralıkta (X-Rad 320 X-ışını ışınlayıcı) iki kez ışınlandı. Bir gün sonra, BM mononükleer hücreleri, her deneyde belirtildiği gibi, femur kemiklerinin yıkanmasıyla donör farelerden izole edildi. Kırmızı kan hücreleri ACK lysing tamponu ile lize edildi ve lenfositler, manyetik mikro boncuklar (Miltenyi) kullanılarak timus hücre yüzeyi Thy1.2'den tükendi. BM hücreleri PBS içinde yeniden süspanse edildi ve toplam 2-5 × 106 BM hücreleri, ışınlanmış farelere intravenöz olarak enjekte edildi. Karışık BM hücresi yeniden oluşturulması durumunda, 1: 1 oranı kullanıldı. Fareler geniş spektrum antibiyotiklerinde bir hafta boyunca tutuldu (1 mg ml−1 Sülfametoksazol ve 0.2 mg ml−1 trimetoprim), ardından fekal gavaj ile mikrobiyom yeniden oluşturulması. Fareler OVA uygulamasından 1-2 ay önce yeniden oluşturuldu. 7 hafta sonra periferik kan örnekleri toplandı ve yeniden oluşturulmayı kontrol etmek için FACS tarafından analiz edildi.
Enzime bağlı immünosorban tahlil
Enzime bağlı immünosorban deneyi (ELISA) plakalar, oyuk başına 100 uL'de PBS içinde OVA (100 uL başına 5 ug) ile kaplandı ve gece boyunca 4 ° C'de bırakıldı. Plakalar beş kez yıkama tamponu (1 x PBS,% 0.05 Tween-20) ile yıkandı ve 100 ul bloke edici tampon (% 3 sığır serum albümini ile 1 x PBS) ile 2 saat 37 ° C'de inkübe edildi. Bloke edici çözelti daha sonra serum numunelerinin seri seyreltileri ile değiştirildi ve oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edildi. Anti-OVA IgG2B'nin (klon C3 Abcam) seri seyreltileri standart olarak kullanıldı. Plakalar üç kez yıkama tamponu ile yıkandı ve daha sonra 1: 5.000 seyreltmede PBS içinde yaban turpu peroksidaza (Jackson immünoresearch) konjüge edilmiş bir anti-fare IgG2B sekonder antikoru ile inkübe edildi. Ek beş yıkamadan sonra plakalar 3.3 ′, 5.5′-tetrametilbenzidin (Thermo Fisher) kullanılarak geliştirildi ve absorbans, bir ELISA mikroplaka okuyucu (Synergy HTX plakası okuyucu, Biotek) kullanılarak 630 nm'de ölçüldü.
İki foton lazer tarama mikroskopi görüntü alımı
Görüntüleme deneyleri için tutarlı bir bukalemun görüş lazeri ile donatılmış bir Zeiss LSM 880 dik mikroskop kullanıldı. Görüntüler, 880 nm'ye ayarlanmış femtosaniye-pullu iki foton lazer kullanılarak elde edildi. Mikroskop, emisyonu bir fotomultiplier tüp dedektörüne bölmek için 565 LPXR içeren bir filtre küpü ile donatıldı (TDTomato floresanı için 579-631-nm filtre ile) ve emisyonu iki gaasp detektörü için 500-550-nm filtreye bölmek için (500-550-nm filtreye ve 4-550-nm flor) bölmek için (Venüs filtresi ile 4-550-nm filtreye bölündü. ECFP floresan). Bütün lenf düğümleri diseke edildi ve mikroskop hedefi altına yerleştirilmeden önce PBS ile bir lamel üzerine yerleştirildi (Zeiss, × 20, 1.05 sayısal diyafram planı hedefi). Fayans görüntüleri olarak elde edildi zıpla her biri arasında 5 um aralıklarla yığınlar zıpla ve zoom 1.5'e ayarlandı. Görüntüler imaris yazılımı (Bitplane) kullanılarak işlendi.
10x genomik scrna-seq
H-2kb-OVA CD8a t hücrelerinin hazırlanması ve izolasyonu
Enfeksiyondan 7 gün önce OVA'ya maruz kalan farelerde LMOVA enfeksiyonundan 7 gün sonra SILP'den lenfositleri izole ettik (Truva at enfeksiyon modeli). Bir kontrol olarak, farelerde LMOVA enfeksiyonundan 7 gün sonra OVA'ya oral yoldan (standart enfeksiyon modeli) 7 gün sonra SILP'den lenfositleri izole ettik (standart enfeksiyon modeli). Hücreler, H-2KB-OVA PE tetramerleri ile boyandı ve PE manyetik mikro boncukları (Miltenyi) ile pozitif seçim kullanılarak OVA'ya özgü CD8aβ T hücreleri için zenginleştirildi. Her numunedeki hücreler benzersiz TotalSeq B hashtag antikorları (BioLegend) ile etiketlendi. Her numuneden hücrelerin boyanması 10x genomik protokolüne göre yapıldı. H-2KB-OVA+ CD8aβT hücreleri DAPI olarak sıralandı-CD19-CD8+H-2KB-OVA+. Saflaştırma, sıralandıktan sonra doğrulandı ve%95'in üzerindeydi. H-2KB-OVA+ CD8aβ T hücreleri 500'de döndürüldüGOda sıcaklığında 4 dakika boyunca ve hücre sayıları bir hemositometre kullanılarak belirlendi. Ayrılmış hücreler, yüklenene kadar buz üzerinde% 0.4 FBS ile PBS içinde yeniden süspanse edildi.
Tek hücreli kütüphane hazırlığı
Hücreler sayıldı ve% 0.04 FBS ile PBS'de nihai bir konsantrasyona seyreltildi. Hücre süspansiyonları karıştırıldı ve üreticinin önerilerine göre 20.000 hücreyi hedefleyen bir 10x genomik GEM-X 3P çip üzerine yüklendi ve daha sonra bir GEM emülsiyonu (10x genomik) oluşturmak için bir krom X cihazında çalıştı. Tek hücreli 3 ′ RNA-seq kütüphaneleri, üreticinin talimatları (10x Genomics Chromium GEM-X tek hücreli 3 ′ V4 gen ekspresyonu, hücre yüzeyi proteini kullanıcı kılavuzu için özellikli barkod teknolojisine sahip) üretildi.
Tek hücreli kütüphanelerin yeni nesil sıralaması
Tek hücreli 3 ′ RNA-seq kütüphaneleri, Illumina (NEB) için bir NEBNext Kütüphanesi miktarı kiti ve yüksek hassasiyet D1000 ekran ve reaktif (Agilent) ile gobestasyon kullanılarak ölçüldü. Kütüphaneler, yüklenen hedef hücre sayısına göre toplandı. Her kütüphane, hücre başına yaklaşık 20.000 okuma derinliğinde sekanslama hedeflenmiştir. Havuzlanmış kütüphane, aşağıdaki okuma uzunluğuyla NovaseQ 1.5b Reaktif Kiti (100 döngü) kullanılarak bir Illumina Novaseq X makinesine yüklendi: 28-BP Read1, 10-BP i5 dizin, 10-bp i7 dizin ve 90-bp Read2.
Tek hücreli 3 ′ gen ekspresyonu verileri
Tek hücreli 3 ′ gen ekspresyon verilerinin demultiplekslenmesi ve işlenmesi, Referans Veri Dosyası Refdata-Gex-MM10-2020-A-10x genomikten indirildi (10x Genomics v.8.0.1) kullanılarak yapıldı (10x Genomics v.8.0.1) (https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mm10-2020-a.tar.gz). Hücre karamsarının demultiplekslenmesi, hücre ranger özellik-barcode matris dosyasına 'filtred_feature_bc_matrix.h5' kullanıldı. Genel olarak, 9.246 hücre, çiftleri (iki antikor etiketi olan hücreler) ve negatifleri (antikor etiketi yok) çıkarmak için süzüldü ve%10'dan fazla mitokondriyal gen sayımı olan hücreler hariç tutuldu. Singlet'ler (8.624 hücre), diyet-OVA-Listeria-OVA ve Listeria-OVA'nın (1.110-1.584 hücre dahil) ilgili üçlü örneklerine atandı. Analiz, 200'den az benzersiz moleküler tanımlayıcı sayısı ve gürültüyü azaltmak için üç hücrede bulunan özelliklere sahip hücreler hariç, Seurat iş akışı ile ilerledi. Normalleştirme, SCTRansform yöntemi kullanılarak uygulandı, ardından hücre döngüsü regresyonu olmadan RunPCA kullanılarak boyutsallık azaltma izlendi. Runumap ve FindNeighbors fonksiyonları 30 ana bileşen kullanılarak uygulandı ve kümeleme 1.2 çözünürlük (FindClusters) ile gerçekleştirildi. Kiratlama olduğundan şüphelenildiği için analizden üç hücre kümesi çıkarıldı. Veriler daha sonra normalleştirildi ve yukarıda tarif edildiği gibi yeniden beslendi, bu da 18 küme ile sonuçlandı. Küme 18 kontaminasyon nedeniyle çıkarıldı. 9 ve 14-17 kümeleri tanımlanmamıştır. Birkaç küme birleştirildi: kümeler 0 ve 2, kümeler 5 ve 8 ve kümeler 11 ve 13. kümeler daha sonra yeniden numaralandırıldı ve gen küme işaretlerine göre tanımlandı.
İstatistiksel analiz
Hayvan çalışmaları için, mutant ve kontrol grupları her zaman benzer SD değerlerine ve dolayısıyla eşleştirilmemiş iki taraflı bir Welch'lere sahip değildi T -Test kullanıldı veya iki yönlü bir ANOVA. Hata çubukları, SD fare örnek boyutu tahminleri, önceki çalışmalarımızdan ve/veya dört ila beş fare kullanan pilot çalışmalardan elde edilen verilere dayanarak belirlenmiştir. Hiçbir örnek analizden çıkarılmamıştır. PDeğerler rakamlarda belirtilmiştir. Kopya sayısı, örneklem büyüklüğü, anlamlılık testleri ve değeri ve anlamı ile ilgili detaylar NHer deney için şekil efsanelerine dahil edilmiştir ve Yöntem.
Raporlama Özeti
Araştırma tasarımı hakkında daha fazla bilgi,Doğa portföyü raporlama özeti Bu makaleye bağlı.