Güncelleme Tarihi: Temmuz 16, 2025 10:56

Postnatal kaçakçılık tarafından sağlanan in vivo hemopoietik kök hücre gen terapisi

Çalışma tasarımı

Farelerle deneylerde örneklem büyüklüğü, deneysel modeller ve deneylerle ilgili önceki deneyime göre seçilmiştir. Analizlerden hiçbir örnek veya hayvan hariç tutulmamıştır. Fareler her deney grubuna rastgele atandı. Müfettişler, LV uygulaması anında yeni doğan ADA-SCID veya OC farelerine kör edildi. Diğer tüm deneysel ortamlarda araştırmacılar kör değildi.

Plazmid yapısı

Pcclsin.cppt.pgk.gfp, pcclsin.cppt.pgk.ada, pcclsin.cppt.pgk.tcirg1 ve pcclsin.cppt.pgk.fanca daha önce tarif edildi^14-19-29-30. Pcclsin.cppt.et.ada.142t, insanı değiştirerek standart klonlama teknikleri tarafından inşa edildi. DÜZELTMEK cDNA⁷ insanla Ada CDNA (spei-sspei), daha önce tarif edilen pcclsin.cppt.et.cofix-r338l.142t (nhei-sali) uçlarını körelttikten sonra içine. Pcclsin.cppt.pgk.Ad.122T plazmid, MiRNA-122 hedef sekansını pcclsin.cppt.pgk.ADA plazmidi (SALI --scai) içine sokarak standart klonlama teknikleri ile oluşturuldu.

Vektör üretimi

Üçüncü nesil kendi kendine inaktive eden LV'ler, 293T hücrelerine kalsiyum fosfat geçici transfeksiyonu ile üretildi. 293T hücreleri, daha önce tarif edildiği gibi seçilen LV genom-transfer plazmidinin bir karışımını içeren bir çözelti ile transfekte edildi⁷. Kısacası, ortam transfeksiyondan 14-16 saat sonra değiştirildi ve süpernatan, ortam değişikliğinden 30 saat sonra toplandı. LV içeren süpernatanlar, 0.22 μm'lik bir filtre (Millipore) ile sterilize edildi, dört kez önceden konsantre edilmiş 200 tangalı akış filtrasyon kaseti 100 kDa (Sartorius), üretim talimatlarına göre, 20.000'de aktarıldı ve santrifüjlendi ve steril polialomer tüplerine (Beckman) merkezde aktarıldı.G 20 ° C'de 120 dakika boyunca (Beckman Optima XL-100K Ultracentrifuge). LV peleti, 500-1.000 × konsantrasyona izin vermek için uygun PBS hacminde çözüldü.

LV Titrasyonu

LV titrasyonu için 1 × 10⁵ 293T hücreleri, polikbren varlığında seri LV seyreltileri ile transdüksiyona tabi tutuldu (8 ug mL^-¹). PGK.GFP-LV için hücreler, transdüksiyondan 5-7 gün sonra Diva yazılımı ile donatılmış bir FACSCANTO analizörü (BD Biosciences) kullanılarak akış sitometrisi ile analiz edildi.^-¹tu ml formülü kullanılarak hesaplandı⁻¹ = ((% GFP⁺ hücreler/100) × 100.000 × (1/seyreltme faktörü)). Diğer tüm LV'ler için, üreticinin talimatlarını takiben Maxwell 48 Hücre DNA saflaştırma kiti (Promega) kullanılarak transdüksiyondan 14 gün sonra genomik DNA (GDNA) ekstrakte edildi. VCN, primerler kullanılarak 5-20 ng şablon gDNA'dan başlayarak DDPCR ile belirlendi (HIV FW: 5′-TACTGACGCTCGCACC-3 ′; HIV REV: 5′-TCTCGACGCAGGACTCG-3 ′) ve bir prob (5′-ATCTCTCTCTCTCtttctttcttctttctttctttctttctttctttcttctttcttctcttctctctctctcttcttcttcttcttcttctcttctcttctctcttctctcttctctctctctctctctctc-bging. Endojen DNA miktarı, insan telomeraz genine karşı tasarlanmış bir primer-prob seti ile ölçüldü (Telo FW: 5′-GGCACACGTGGCTTTTCG-3 ′; Telo Rev: 5′-GGTGAACCTCGTAAGTTTTATGCAA-3 ′; TelO Problemi: 5p-tcagacgtcggtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgttttttttttttgtgtgtgtgttttttttttttgtgtgtgtgtgttttttttttttttttgtgtgttttttttttttttttttttot). insan Gapdh Gen (Uygulamalı Biyosistemler HS00483111_CM). PCR reaksiyonu, üreticinin talimatları (Bio-Rad) ardından her primer (900 nm) ve prob (250 nm; Telo için 500 nm) ile gerçekleştirildi, QX200 okuyucu ile okundu ve Quantasoft yazılımı (Bio-Rad) ile analiz edildi. Tu ml olarak ifade edilen bulaşıcı titre^-¹tu ml formülü kullanılarak hesaplandı^-¹ = (VCN × 100.000 × (1/seyreltme faktörü). LV fiziksel partikülleri, üreticinin talimatlarını takiben HIV-1 GAG P24 antijen immünokaptur deneyi (Perkin Elmer) ile ölçüldü. LV-spesifik enfektivite, bulaşıcı titre ve fiziksel parçacıklar arasındaki oran olarak hesaplandı.

VCN Tespiti

Fare deneyleri için DNA, Maxwell 48 doku DNA saflaştırma kiti (Promega) kullanılarak tüm karaciğerden, Maxwell 48 hücre DNA saflaştırma kiti (Promega) kullanılarak timus, dalak veya BM'den elde edilen bir hücre süspansiyonundan veya Maxwell 48 tam kan DNA saflaştırma kiti (Promega) kullanılarak tüm PB'den alındı. DNA, soy negatifinden çıkarıldı (lin^-) hücre sayısına göre Maxwell 48 hücre DNA saflaştırma kitini (Promega) kullanan ve hızlı ekstrakt DNA (BioSearch Technologies) kullanılarak tek seçilmiş kolonilerden kültürlenmiş hücreler. Fare DNA'daki VCN, LV'lerin primer bağlayıcı bölgesine göre tasarlanmış bir primer-prob seti kullanılarak 5-20 ng şablon gDNA'dan başlayarak DDPCR ile belirlendi (bkz. 'LV Titrasyon' bölümüne bakınız). Bazı durumlarda, VCN, ters transkripsiyonlu vektör genomunu (hem entegre hem de entegre edilmemiş) seçici olarak amplifiye eden, olası plazmid kontaminasyonundan ayrım yapan geçici bir DDPCR (QX200 Evagreen Dijital PCR SuperMix, Bio-Rad) kullanılarak belirlendi.²⁹ (RT-LV; ΔU3 FW: 5′-TCACTCCCAACGAAGACAAGATC-3 ′, GAG REV: 5′-GAGTCCTGCGTCGAGAGAG-3 ′). Endojen fare DNA miktarı, fareye karşı tasarlanmış bir primer -prob seti ile ölçüldü Sema3a gen (Sema3a FW: 5′-ACCGATTCCAGATGATTGGC-3 ′; Sema3a Rev: 5´tccatattaatgcagtgctgc-3 ′; Sema3a Prob: Hex 5′-AGAGGCCTGTCCTGCAGCTCATGG-3 ′ BHQ1). PCR reaksiyonu, her bir primer (RT-LV primerleri için 900 nm; 150 nm) ve üreticinin talimatlarını (Bio-Rad) izlenerek prob (250 nm) ile gerçekleştirildi, QX200 okuyucu ile okundu ve Quantasoft Software (Bio-Rad) ile analiz edildi.

RNA ekstraksiyonu ve DDPCR

RNA ekstraksiyonu, üreticinin talimatlarına göre bir Maxwell 48 SimplyRNA kan ekstraksiyon kiti (Promega, AS1380) kullanılarak yapıldı ve SuperScript IV Vilo Kit (11766050; Thermofisher Scientific) kullanılarak ters kopyalandı. LV gen ekspresyonu, LV genomunun (WPRE FW: 5′-GGCTGTGTGGGCACTGACAAT-3 ′; 5′-ACGTCCGCGGCAGAATC-3 ′: FAM 5p-TTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGT-3 ′ MGB). HPPT fare numuneleri için bir referans gen olarak kullanıldı (DMMUCPE5095493, Bio-Rad). PCR reaksiyonu, üreticinin talimatlarını (Bio-Rad) takiben her bir primer (900 nm) ve prob (250 nm) ile gerçekleştirildi, QX200 okuyucu ile okundu ve Quantasoft Yazılımı (Bio-Rad) ile analiz edildi.

Hücre kültürleri ve in vitro deneyler

293T hücre hattı,% 10 fetal sığır serumu (FBS; Fetalclone II, Hyclone, Euroclone), 4 mm glutamin (Lonza), 100 Uluslararası Birlik (IU) ile takviye edilmiş ISCove Modifiye Dulbecco'nun ortamında (IMDM, Sigma), 100 Uluslararası Birlik (IU)^-¹ Penisilin ve streptomisin (Lonza). Birincil fare lin^- Hücreler, BM'den veya LV ile tedavi edilen farelerin karaciğerinden elde edilen ve% 10 FBS, 4 mM glutamin, 100 IU ml ile takviye edilen gövdelerde kültürlenen hücre süspansiyonlarından FACS-sıralandı^-¹ Penisilin ve streptomisin, 100 ML^-¹ Fare kök hücresi faktörü (MSCF, Peprotech), 50 ng ml^-¹ Fare trombopoietin (MTPO, Peprotech), 100 ml^-¹ Fare FMS benzeri tirozin kinaz 3 ligandı (MFLT3L, Peprotech) ve 20 ng ml^-¹ Fare interlökin-3 (MIL-3, Peprotech) 24 saat boyunca. Ortam daha sonra% 10 FBS, 100 IU ML ile desteklenmiş IMDM ile değiştirildi^-¹ Penisilin ve streptomisin, 100 ML^-¹ MSCF (Peprotech) ve MFLT3L 100 ML^-¹ (Peprotech) 48 saat boyunca. Son olarak, GFP ifadesi Diva yazılımı ile donatılmış bir FACSCanto Analizörü (BD Biosciences) kullanılarak belirlendi. Sıralı Lin'den bazıları^- Hücreler, 100 ng ml ile desteklenmiş klasik metocult (Stemcell Technologies) içinde kaplandı (plaka başına 800 hücre)^-¹ MSCF (Peprotech), 50 ML^-¹ MTPO (Peprotech), 100 ML^-¹ MFLT3L (Peprotech) ve 20 ML^-¹ MIL-3 (Peprotech). Tüm hücreler% 5 CO'da tutuldu₂ 37 ° C'de nemlendirilmiş atmosfer. Hücre çizgileri mikoplazma kontaminasyonu için rutin olarak test edildi.

Fare deneyleri

Kurucu FVB, 129-ADATM1MW TG (PLADA) 4118RKMB/J fareleri (ADA-SCID fareleri olarak adlandırılır) Jackson Laboratuvarı'ndan elde edildi³¹ (Stok 003265). Kurucu B6C3FE A/A-TCIRG1OC/J fareleri (OC fareleri olarak adlandırılır) Jackson Laboratuvarı'ndan elde edildi¹⁶ (Stok 00230) ve C57BL/6 arka planında tamamen geri döndü. İçinde hedeflenen bir kesintiye sahip kurucu fareler Fance gen³² H. J. van de Vrugt (ücretsiz Üniversite Tıp Merkezi) tarafından sağlandı ve FVB fareleriyle geri döndü. Fance^-^/^- FVB suşu (olarak adlandırılır Fance^-^/^- fareler). C57BL/6 ve NSG fareleri Charles River Laboratories'den satın alındı. Tüm fareler spesifik patojende tutuldu-ücretsiz koşullar. ADA-SCID ve OC farelerinin genotiplenmesi, Jackson Laboratuvarı web sitesinde bulunan protokole göre 2-3 haftalıklarda gerçekleştirildi. Vektör uygulaması yetişkin dişi C57BL/6 veya NSG'de gerçekleştirildi (7-10 haftalık-Eski) fareler kuyruk-vahşi enjeksiyon (fare başına 250-300 uL), yenidoğanlarda temporal-vahşi enjeksiyon (fare başına 30 uL) ve 2 haftalık farelerde retro-orbital enjeksiyon (fare başına 100-150 uL) ile. Fareler, kılcal tüpler kullanılarak retro-orbital pleksustan kanadı ve kan% 0.38 sodyum sitrat tamponu, pH 7.4 veya EDTA kaplı bir tüpte (Microvette 20.1341) toplandı. Transplantasyon deneyleri için, 7 haftalık dişi C57BL/6 alıcı fareleri, ölümcül bir busulfan rejimi ile koşullandırıldı (6 mg mL^-¹), 27 ug g günlük dört intraperitoneal (IP) uygulamasından oluşan^-¹ Busulfan (% 0.9 NaCl enjekte edilebilir çözelti içinde 1: 2 öngörüldü). Transplant, toplam BM hücrelerinin IV enjeksiyonu veya toplam CD45 ile gerçekleştirildi⁺ Busulfan'ın son dozundan sonraki gün karaciğerden veya donör farelerinin BM'sinden hücreler fakslı (BD facsaria füzyon hücre sıralayıcı, BD Biosciences veya Moflo Astrios EQ hücre sıralayıcısı, Beckman Coulter). Hücreler 200 ul PBS içerisinde yeniden süspanse edildi. Transplante edilen hücrelerin tipi ve sayısı deney şemalarında belirtilmiştir. Alıcı farelerin ağırlığı, Busulfan uygulaması sırasında günlük olarak ve nakilden sonra 1 ay boyunca haftalık olarak izlendi. NSG farelerinde transplantasyon deneyleri durumunda, koşullandırma, ışınlamadan 3-4 saat sonra alıcı farelerin (200 RAD) ve transplantasyonun sublethal ışınlaması ile gerçekleştirildi. Transplantasyon deneyleri için Fance^-^/^- Fareler, kondisyonlama, alıcı farelerin iki doz 4.5 gy 24 saat aralık kullanılarak ölümcül ışınlanmasıyla gerçekleştirildi. Koşullamadan toplam 3-4 saat sonra, 4-5 × 10⁶ LV ile tedavi edilen veya tedavi edilmeyen BM hücreleri Fance^-^/^- Fareler, alıcı farelerin kuyruk damarında IV enjeksiyonu ile nakledildi. HSPC mobilizasyonu, 2 haftalık veya yetişkin farelerde 250 ng g beş IP dozu uygulanarak gerçekleştirildi⁻¹ 12 saat aralıklı fare başına G-CSF. Daha sonra G-CSF'nin son dozundan 8 saat sonra 2 ug g⁻¹ Fare başına plerixafor, mobilize farelere IP uygulandı. LV'ler, Plerixafor'dan sonra IV 2 saat uygulandı ve aynı zamanda FACS analizi için BM, Pb veya dalaktan hematopoietik hücreler toplandı. HSPC mobilizasyonu, yeni doğan farelerde, 2 haftalık veya yetişkin farelerde kullanılan aynı protokolün ardından, beş doz yerine üçten oluşan bir G-CSF rejimi dışında gerçekleştirildi. Anti-IFNa reseptör bloke edici antikor (MAR-1, İstenmeyenMAb, MAR1-5A3) veya IgG kontrolü (İstenmeyenMAb, fare IgG1 izotip kontrolü, MOPC-21), 50 mg kg'da LV uygulamasından 3 saat önce yeni doğan farelere IV uygulandı^-¹ doz. BM başarısızlığı indüklendi Fance^-^/^- IP ile fareler 0.3 mg kg'lık iki dozun^-¹ 7 gün aralıklı, LV enjeksiyonundan 6 hafta sonra mitomisin C (Milliporesigma)²⁰. Fareler co tarafından ötenazi yapıldı₂ planlanan zamanlarda inhalasyon. Deneysel prosedürler Fance^-^/^- Fareler, Avrupa ve İspanyol düzenlemelerine göre (Avrupa Konvansiyonu ETS 123, deney ve diğer bilimsel amaçlarda kullanılan omurgalı memelilerin kullanımı ve korunması, 2010/63/ue direktifi, İspanyol yasası 6/2013 ve gerçek Decreto (RD) 53/2013, bilimsel araştırmalarda hayvanların korunması ve kullanımı ile ilgili olarak gerçekleştirildi. Tüm hayvan prosedürleri, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre yapıldı.

Karaciğer, Thymus, Dalak ve BM fraksiyonları

Fare karaciğeri perfüze edildi (15 ml dakika^-¹) sonraki adımlarda aşağıdaki çözeltilerden 12.5 mL ile inferior vena kava aracılığıyla: (1) PBS EDTA (0.5 mm); (2) HBSS (GIBCO) ve HEPES (10 mm); ve (3)% 0.03 kolajenaz IV (Sigma) içeren HBSS ve HEPE'ler. Sindirilmiş fare karaciğer dokusu toplandı, 100 um'lik bir hücre süzgeçten (BD Biosciences) geçirildi ve tek hücreli bir süspansiyon haline getirildi. Bu süspansiyon daha sonra üç kez santrifüjlendi (30G25G ve 20G3 dakika boyunca, oda sıcaklığında) hepatosit içeren peletleri uzaklaştırmak için. Parenkimal olmayan hücreler içeren süpernatant santrifüjlendi (650G7 dakika, oda sıcaklığında) ve geri kazanılan hücreler daha sonra 'akış sitometrisi' bölümünde belirtilen monoklonal antikorlarla inkübe edildi. Tek hücreli bir dalak veya timus süspansiyonu elde etmek için organlar, PBS-% 2 FBS (Fetalclone II, Hyclone, Euroclone) kullanılarak 40 um bir filtre üzerine parçalandı, kırmızı kan hücreleri (RBC'ler), ICE'de 0.5 veya 1 mL ACK lysing tamponu (gibco) ile lize edildi. Lizis, 10 mL PBS -% 2 FBS ilave edilerek durduruldu. Hücre süspansiyonu daha sonra 40 um'lik bir filtre ile süzüldü ve hücreler sayıldı ve gDNA ekstraksiyonu veya akış sitometri analizi için kullanıldı (bkz. 'Akış sitometrisi' bölümü). BM hücreleri, gerektiğinde bir veya iki bacağın tibia ve femurundan yıkandı veya yenidoğan veya OC fareleri durumunda kemik ezme ile ekstrakte edildi ve daha sonra dalaktan izole edilen hücreler için tarif edildiği gibi işlendi.

Akış sitometrisi

BM, Spleen, Thymus, Pb veya karaciğerden elde edilen hücre süspansiyonları kullanılarak akış sitometri analizleri, Diva yazılımı ile donatılmış bir FACSCanto analizörü (BD Biosciences) kullanılarak yapıldı. 500.000 ila 1.000.000 hücre işlendi, PBS ile yıkandı-% 2 FBS (fetalclone II, Hyclone, Euroclone) veya MACS tamponu (PBS pH 7.2, BSA), 2 mM EDTA), fragman kristalize edilebilir (FC) reseptörü ile işlendiğinde, daha sonra işlenirken işlenir. Yıkama için kullanılır. Boyama MACS tamponunda gerçekleştirildi ve hücreleri antikorlarla inkübe ederek (ek tabloda belirtilen oranda 15) karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika boyunca. Analizden hemen önce, ölü hücreleri hariç tutmak için her tüpe 3 ul 7-AAD (BioLegend 420404) ilave edildi. Cihaz dedektörlerini kalibre etmek için gökkuşağı boncukları (BD Biosciences) kullanıldı. Gating stratejileri ek incir. 1-4. Summit Software (Beckman Coulter) ile donatılmış Diva yazılımı (BD Biosciences) veya Moflo Astrios EQ hücre sıralayıcısı (Beckman Coulter) ile donatılmış bir BD Facsaria füzyon hücre sıralayıcısı (BD Biosciences), hücre sıralaması için kullanıldı.

Şek. 1b - i ve genişletilmiş veriler Şekil. 1A - Dnumuneler iki standartlaştırılmış çok parametrik akış sitometri deneyleri kullanılarak analiz edildi^21-33 (tam kan diseksiyonu yoluyla). Kısacası, ACK lysing tamponu (kök hücre teknolojileri) ile RBC lizisinden sonra, örnekler ek tabloda bildirilen floresan antikorlarla etiketlendi 16. En iyi antikor konsantrasyonunu değerlendirmek için titrasyon deneyleri yapıldı. Farelerden alınan numuneler, bir sıçan anti-fare FCR engelleme reaktifi (BD, Seyreltme 1: 100) ile önceden inkübe edildi. Yüzey işaretinden sonra hücreler, ölü hücreleri lekelemek için propidyum iyodür (PI; biolegend) ile inkübe edildi. Mutlak hücre niceliği, boyama prosedüründen önce PB örneklerine hassas sayım boncukları (BioLegend) ilave edilerek gerçekleştirildi. Tüm lekelenmiş numunelerin görüntüleri, gökkuşağı boncukları (Spherotech) ile kalibrasyondan sonra bir BD Senfoni A5 (BD Bioscience) sitoflorimetre ile elde edildi ve Ham Veriler Diva yazılımı (BD Biosciences) kullanılarak toplandı. Veriler daha sonra FlowJo Software v.10.5.3 (BD Biosciences) ile analiz edildi. Ek tabloda fare veya insan tam kandan çıkma panelleri için kullanılan antikorların bir listesi rapor edilmiştir. 16.

IRCCS Ospedale San Raffaele'nin etik komiteleri tarafından onaylanan protokoller kullanılarak pediatrik ve yetişkin sağlıklı donörlerden PB örnekleri toplandı ve analiz edildi. Pediatrik katılımcılar için yazılı onay ebeveynleri tarafından verildi.

İmmünohistokimya görüntüleme

Fareler sol ventrikülden, kanın uzaklaştırılması için 0.5 mM EDTA içeren PBS ile perfüze edildi, daha sonra organlar toplandı ve en az 24 saat boyunca çinko-formalin içinde sabitlendi. San Raffaele Hastanesi'nde (İtalya) Centro Di Imaging Sperimentale tesisinde gömme, bölümleme, slayt hazırlığı, boyama ve görüntü edinimi yapıldı. Formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü ardışık bölümler (4 uM), histolojik veya immünohistokimyasal boyamadan önce dereceli bir alkol serisinden rehidre edildi. İmmün boyama otomatik Leica Bond Rx sistemi (Leica Microsystems) kullanılarak gerçekleştirildi. Dokular ilk olarak deparaffine edildi ve epitop alım çözümü 1 (ER1 sitrat tamponu) kullanılarak epitop alımına tabi tutuldu. Slaytlar, bir anti-GFP primer antikoru (Invitrogen, A11122, 1: 1,000) veya bir anti-Ki-67 primer antikoru (D3B5, hücre sinyalleme teknolojisi, 1: 200) ile oda sıcaklığında 30 dakika sürdürüldü, ardından Bond Polimer Rafin Detayleme Kiti (LEICA, DS9800) kullanılarak tespit edildi. Lekeli slaytların görüntüleri, 20 × büyütme (Leica Biosystems) üzerinde bir Aperio AT2 dijital tarayıcı kullanılarak elde edildi ve Imagescope yazılımı (Leica Biosystems) ile analiz edildi.

Entegrasyon bölgesi analizi

Entegrasyon siteleri, daha önce tarif edildiği gibi sonikasyon bağlayıcı aracılı (slim) -pcr tarafından alındı.³⁴küçük değişikliklerle. Kısacası, her bir numune için 300 ng'ye kadar gDNA, Covaris E220 ultrasonicator kullanılarak DNA kesme ile işlendi ve ortalama 1.000 bp boyutuna sahip fragmanlar üretildi. Parçalanmış DNA, son onarım ve 3 adenilasyona tabi tutuldu ve daha sonra numune tanımlaması için kullanılan sekiz-nükleotid sekans barkodunu içeren bağlayıcı kasetlere ve Read 2 eşleştirilmiş uç sekanslama için gerekli tüm sekanslara bağlandı. Ligasyon ürünleri üç teknik kopyaya bölündü ve LV LTR ve bağlayıcı kaset için spesifik primerler kullanılarak 35 döngü üstel PCR'ye tabi tutuldu. Bağlayıcı kaset ve LTR için spesifik bir primer kullanılarak ek on PCR döngüsü ile daha sonraki bir amplifikasyon gerçekleştirildi. Bu primerler, numune tanımlaması için kullanılan bir 8-nükleotid barkod (bağlayıcı kaset üzerindeki barkod ile birleştiğinde) ve okuma 1 sekanslama için gereken sekanslar ve rastgele bir 12-nükleotit sekansı içerir ve sonraki jenerasyon sıralama sistemindeki ilk sıralama döngülerinde daha kolay küme tanıma sağlar. Bu nedenle üretilen ince-PCR ürünleri, kütüphanelere monte edilmiş ve Illumina yeni nesil sekanslamaya maruz kalan benzersiz bir çift barkod ile ilişkilidir.

Biyoinformatik analiz

Sekans okumaları özel bir biyoinformatik boru hattı kullanılarak işlendi³⁵ (VISPA2), vektör LTR'yi kuşatan ve bunları fare genomuna (MM9) eşleyen genomik sekansları izole eden. Farklı hücrelerde aynı genomik pozisyonda vektör entegrasyonu çok düşük bir olasılık olayı olduğundan, bağımsız örneklerdeki özdeş entegrasyon bölgeleri, teknik prosedür sırasında ortaya çıkabilecek kontaminasyon veya amplifikasyon artefaktları olarak kabul edildi. Veri kümeleri, her bir birincil fare ve ilgisiz ikincil farelerden türetilen entegrasyon alanları için potansiyel kontaminasyon ve yanlış pozitiflerden budandı. Farklı deney gruplarına ait fareler arasında paylaşılan özdeş entegrasyon alanları, yerleştirme bölgesi en az iki ince teknik kopyada ve dizi sayımları ile tanımlanarak yeniden atanmıştır. Göreceli bolluk, paylaşım ve CIS analizi gibi vektör entegrasyon bölgelerinin aşağı akış analizleri, isanalyitikler kullanılarak yapıldı³⁶. Genom sayılarının nispi yüzdesi olarak tahmin edilen klonal bolluk, R paketi sonicLength tarafından belirlendi³⁷. Yaygın ekleme bölgeleri, aykırı değerler için Grubbs testi kullanılarak hesaplandı.³⁸.

Hemositometrik analiz

Pb'nin hemositometrik analizi, deneysel tasarım şemalarında belirtilen zaman noktalarında bir ProCyte DX analizörü (IDEXX) kullanılarak yapıldı. Yaklaşık 30 uL Pb, EDTA kaplı tüplere (Microvette 20.1341) toplandı ve analiz edildi. Ölçülen parametreler şunlardır: hemoglobin, toplam RBC sayısı, diferansiyel sayı (lenfosit, monosit ve nötrofil (mutlak sayı ve yüzde)), trombosit sayısı ve toplam lökosit sayısı (beyaz kan hücresi).

ADA etkinliği

ADA aktivitesi, daha önce tarif edildiği gibi plazmada veya Pb'nin hücresel fraksiyonu içinde ölçüldü³⁹. Kısacası, 20 ul paketlenmiş RBC, 20 ul lizis tamponu içinde lize edildi (0.25 mol L^-¹ Hepes, 0.025 mol l^-¹ Ahbaplar ve 0.025 mol l^-¹ ditiothreitol). Hücre lizatı 12.000'de santrifüjlendiG 5 dakika boyunca. Enzim aktivitesi, 50 mmol L içeren bir karışımda değerlendirildi^-¹ Tris (pH 7.2) ve 0.4 mmol L^-¹ 10 ul lized RBC süpernatan veya 20 ul plazma ilave edilerek adenosin. Reaksiyon PCA eklenerek durduruldu (nihai konsantrasyon, 0.21 mmol L^-¹) ve KOH ile nötralize (son konsantrasyon, 0.22 mmol l^-¹). Reaksiyon ilerlemesi, hücresel fraksiyon için 0 ve 10 dakikada veya plazma için 0 ve 30 dakika sonra inosin artı hipoksantin oluşumundan sonra iki zaman noktalarında (Bio-Rad) iki zaman noktalarında alikotlar kullanılarak analiz edildi. Enzim aktivitesi mol H olarak ölçüldü⁻¹ PER (ML Paketlenmiş RBC'ler veya ML Plazma).

Osteoklast farklılaşması, CTX ve paratiroid hormonu ELISA ve dentin deneyi

Osteoklastlar, daha önce tarif edildiği gibi BM hücrelerinden farklılaştırıldı⁴⁰ ve dentin slaytlarında (AE8050) rezorpsiyon fonksiyonları için test edildi. Dentin diskleri daha önce tarif edildiği gibi toluidin mavisi ile boyandı⁴⁰. Kültür süpernatanında salınan CTX konsantrasyonu, üreticinin protokolünü takiben enzime bağlı immünosorban deneyi (ELISA; çapraz bağlantı, AC-07F1, immünodiyagnostik sistem) ile ölçüldü. LV ile tedavi edilen OC veya WT farelerinin serumundaki paratiroid hormonu konsantrasyonu, üreticinin protokolünü takiben ELISA (Microvue fare paratiroid hormonu 1-84 EIA) ile ölçüldü.

Mikro-bilgisayarlı tomografi

Mikro-bilgisayarlı tomografi analizleri için, OC farelerinin vertebral kolonları ve WT çöp arkadaşları diseke edildi, bağ dokularından temizlendi ve% 4 paraformaldehit içinde sabitlendi. Kemikler, 0.25 mm alüminyum filtre kullanılarak 55 kV ve 72 uA'da bir Skyscan 1276 (Bruker) kullanılarak 7 um'lik bir nominal görüntü çözünürlüğünde tarandı. Görüntüler, 2 × 2 kamera piksel binning ile 360 ° 'ye dönüşte bir 0.4 °' ye yakalandı. Yeniden yapılanma, Instarecon Reconstrictasyon Motoru, halka artefakt azaltma ve ışın sertleştirme düzeltmesi kullanılarak Skyscan NRecon 2.0.0.5 yazılımı ile gerçekleştirildi. L5 vertebra'nın görüntü analizi CT analizör yazılımı (CTAN 1.18.8.0+) kullanılarak gerçekleştirildi. Koronal düzlemdeki vertebral vücudun trabeküler bölgesini segmentlere ayırmak için şirket içi bir yarı otomatik yaklaşım kullanıldı. Trabeküler bölgenin kemik mineral yoğunluğu, 0.25 ve 0.75 g cm içeren 2 mm'lik bir fantom çubuk çiftinin seçilmiş bölgelerinin ortalama zayıflama katsayılarına karşı doğrusal bir ekstrapolasyonun kalibre edilmesi ile hesaplandı.^-³ Caha (Skyscan). Trabeküllerin üç boyutlu bir morfometrik analizi, trabeküllerin adaptif bir eşikleme algoritması ile binarizasyonundan sonra gerçekleştirildi. Kemik hacmi ile toplam hacim (%) ile trabeküler ayırma (mm) arasındaki oran değerlendirildi.

İstatistiksel analizler

İstatistiksel analizler, San Raffaele Üniversitesi Biyomedikal Bilimler İstatistik Merkezi'nde (CUSSB) profesyonel istatistikçilere danıştıktan sonra yapıldı. Normallik varsayımları karşılanmadığında parametrik olmayan istatistiksel testler yapıldı. İki kuyruklu bir Mann-Whitney U-Test iki bağımsız grubu karşılaştırmak için gerçekleştirildi ve ikiden fazla bağımsız grup için bir Kruskal -Wallis testi kullanıldı, ardından hoc analiz (Dunn'ın Bonferroni düzeltmesi ile birlikte referans kontrol grubuna karşı çoklu karşılaştırmalar için testi). Eşleştirilmiş gözlemler için bir Wilcoxon eşleştirilmiş çift testi yapıldı. Veriler GraphPad (V.10) kullanılarak analiz edildi. Tekrarlanan ölçüm tasarımının neden olduğu bağımlılıkları doğru bir şekilde hesaplayan biyolojik süreçlerin dinamiklerini modellemek için LME modelleri tahmin edildi ve deney birimleri veya oturum için rastgele etki terimleri belirtildi. Altta yatan model varsayımlarını yerine getirmek için, logaritmik, kare/kübik kök ve sıralı kantil normalizasyonu dahil olmak üzere sonuç değişkeninin çeşitli dönüşümleri dikkate alınmıştır. LME modellerinin tahmin edilmesinden sonra, sabit bir zaman noktasında tedavi gruplarının çift karşılaştırılmasını sağlayan bir post hoc analiz gerçekleştirildi. Çokluk sorunlarını hesaba katmak için, PDeğerler Bonferroni'nin yaklaşımı kullanılarak ayarlandı. LME, R yazılımı (v.4.3.1) kullanılarak tahmin edildi. Tüm analizlerde, önem eşiği 0.05 olarak ayarlandı. Yeterli örnek boyutları için çıkarımsal teknikler kullanıldı (N≥ 5), aksi takdirde sadece tanımlayıcı istatistikler rapor edilir.

Raporlama Özeti

Araştırma tasarımı hakkında daha fazla bilgi,Doğa portföyü raporlama özeti Bu makaleye bağlı.