Kokain kemogenetiği, sentetik fizyolojiyle uyuşturucu arayışını köreltiyor

DNA yapıları

α7–5HT3 ve α7–GlyR dizileri daha önce bildirilenlerle aynıydı¹¹. Sahaya yönelik mutajenez, QuickChange Lightning SDM (Agilent) kullanılarak gerçekleştirildi. Bu yapılar için a7 nAChR LBD, insan dizisini temel aldı. CHRNA7. 5HT3 IPD, fare dizisine dayanıyordu. GlyR IPD insan sekansına dayanıyordu. İnsan embriyonik böbrek (HEK) hücrelerinde test yapmak için kanallar pcDNA3.1’den (Invitrogen/Thermo Fisher Scientific) ifade edildi.

Cre’ye bağımlı rAAV için Coca-GlyR ve ardından IRES-mCherry içeren yapılar bir AAV2-Synapsin(Syn)-FLEX vektörüne klonlandı⁵⁷ göre ters yönde Sen organizatör. Bu yapılar kullanılarak rAAV serotip 1, Janelia Moleküler Biyoloji Temel Tesisi tarafından üretildi.

Coca-5HT3 (α7(L141G,G175K,Y210F,Y217F)–5HT3) veya coca-GlyR (α7(L141G,G175K,Y217F)–GlyR), ardından IRES-mCherry, akış aşağısındaki bir AAV2 vektörüne klonlandı. Sen promoteriydi ve ayrıca AAV serotip 5 (Janelia) olarak paketlendi.

CA1 piramidal hücrelerinde elektroporasyon ve in vitro elektrofizyoloji için, mutant kanal cDNA’ları, yukarı yönde bir CAG promoteri ve aşağı yönde bir IRES-GFP sekansı ile bir pCAG ekspresyon vektörüne klonlandı.

İyon kanalı amino asit kalıntısı pozisyonları için kullanılan numaralandırma şeması, cDNA dizilerinden türetilen işlenmemiş ön-protein dizisine dayanmaktadır.

Kokain-LBD etkileşimlerinin yapısal modeli

AChBP ile bir kompleks içindeki kokainin kristal yapısı Protein Veri Bankasından (PDB:) elde edildi. 2PGZ). Gösterim amacıyla insan protein dizisindeki homolog kalıntılar için kristal yapıdaki kokaine yakın kalıntılar için PyMol’de amino asit ikameleri yapıldı. Model, kokain agonizmi üzerindeki etkiler için mutasyona uğratılacak kalıntıların araştırılmasına rehberlik etmek için kullanıldı.

Membran potansiyeli tahlili kullanılarak iyon kanalı testi

ATCC CRL-1573 hücreleri (HEK293, pasajlar 40-49), 3 x 106 cm’de Corning CellBIND plakalarına (10 cm çap) kaplandı.⁶ Plaka başına hücre sayısı ve yaklaşık %80 birleşme elde etmek için 18-24 saat büyütüldü. HEK293 hücre çizgisi sıklıkla yanlış tanımlanmasına rağmen, onu doğrudan ATCC’den elde ettik ve bu hücreleri kullandık çünkü kimerik iyon kanalları yapıları verimli bir şekilde transfekte edildi ve bu hücre çizgisinde iyi eksprese edildi. Hücre çizgileri mikoplazma kontaminasyonu açısından test edildi. Kirlenmiş kültürler tespit edilirse deneyler için kullanılmadılar.

Hücreleri transfekte etmek için Opti-MEM (500 ul, Invitrogen), DNA plazmidi (10 ug) ve FuGene HD (30 ul, Roche) birleştirildi, 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi ve daha sonra karışım, 10 cm’lik hücrelere damla damla ilave edildi.² plaka. Hücreler 37 °C’de %8 CO2’de inkübe edildi₂/hava. İlave 18-20 saat sonra ortam aspire edildi ve hücreler durulandı (1 x PBS, 5 mi), %0,05 trypsin-EDTA (3,0 mi, 5 dakika) ile işlendi ve DMEM + %10 FBS (7,0 mi) ile nötrleştirildi. Hücreler toplandı, santrifüj edildi (100G2 dakika) ve DMEM + %10 FBS içerisinde yeniden süspanse edildi ve ardından sayıldı (Beckman Coulter Vi-Cell XR hücre analizörü). Hücreler daha sonra 96 ​​kuyucuklu BIOCOAT poli-D-6 × 106 hücre yoğunluğuna sahip lizin siyahı/şeffaf hücre yapısı⁴ oyuk başına 200 ul içinde canlı hücreler. Hücreler 22-26 saat daha (%8 CO2’de 37 °C) inkübe edildi.₂) daha sonra ortam aspire edildi ve FLIPR membran potansiyeli tahlil çözeltisi ilave edildi ve yaklaşık 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi.

Membran potansiyeli tahlil çözeltisi, 200 ml HEPES tamponlu Earle dengeli tuz çözeltisi (HEBSS) içerisinde çözündürülmüş bir şişe Molecular Devices membran potansiyeli tahlil kiti-Blue (R8034) ile hazırlandı. İlaç bileşiği plakaları, HEBSS (<%0.5 DMSO) içindeki Nalge Nunc 96 oyuklu konik tabanlı plakalarda hazırlandı ve 0.1 uM ila 100 uM arasındaki konsantrasyon aralıklarında test edildi. (<%0,1 DMSO)

Amfetamin ve kokain (Sigma-Aldrich), seyreltme serisini yapmadan önce salin içinde 100 mM’lik bir stokta eritildi. Nikotin, >%99 sıvıdan (Sigma-Aldrich) salin içinde 100 mM stok halinde çözüldü. Kontrol edilen diğer maddelerin tümü, metanol (Sigma-Aldrich) içindeki Cerilliant ACS Kimyasal Standart çözeltilerinden SpeedVac (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak 1 mg miktarlarda izole edildi ve DMSO stokunda 100 mM’ye kadar çözündürüldü. Bu seyreltmelerde yanıt olmadığından emin olmak için tek başına DMSO da test edildi. Koka-5HT3’te test için endojen aminler (Genişletilmiş Veri Şekil 1). 3) 100 mM stoklara kadar salin içinde çözüldü.

İyon kanalı aktivasyonunu ölçmek için Hamamatsu FDSS 6000 plaka okuyucu ve sıvı işleme sistemini kullandık. Analiz plakaları 1 Hz’de tarandı (uyarma, 472/30 nm; emisyon, 540/40 nm). Bileşik çözeltileri (50 ul), 10 temel taramanın ardından 96 kuyucuklu bir bileşik plakadan eş zamanlı olarak verildi ve bunu 170 ek tarama izledi. MP EC’yi hesaplamak için₅₀her kuyucuk için maksimum yanıt çıkarıldı, her bileşik için maksimum yanıta normalleştirildi ve MATLAB’da yazılan yazılım (MathWorks Central: ec50.m, C. Evangelista, v.1.0, 14 Ocak 2004) ve İstatistik Araç Kutusu’ndaki nlinfit işlevi kullanılarak sigmoidal doz-yanıt eğrileri hesaplandı.

HEK293 hücre elektrofizyolojisi

Kanal mutantları ve agonistleri, HEK293 hücreleri üzerinde gerçekleştirilen tam hücre voltaj kelepçe deneylerinde ayrıca karakterize edildi. 44-48. pasajlarda hücreler düşük yoğunlukta (1 x 106) kaplandı.³ cm başına²) poli-D-lisin kaplı cam lamelleri, daha sonra 10 cm’de transfekte edilir² Hem iyon kanalı cDNA’sını (pcDNA3.1, oyuk başına 2 µg) hem de GFP için cDNA’yı (pCMV, oyuk başına 0,1 µg) içeren DNA plazmitleri ile Fugene 6 transfeksiyon reaktifini (Roche) kullanan kuyucuklar, ardından 3 saat sonra ortamın değiştirilmesi yapılır. Kayıtlar transfeksiyondan 24-72 saat sonra yapıldı.

Elektrofizyolojik kayıtlar, pClamp yazılımı ve bir Multiclamp 200B amplifikatörü (Molecular Devices) kullanılarak ters bir floresan mikroskobu (Olympus IX-51) üzerinde tam hücre voltaj kelepçe modunda gerçekleştirildi. Elektrofizyolojik veriler 4 kHz’de filtrelendi, bir Digidata 1400 arayüzü (Molecular Devices) kullanılarak 10 kHz’de dijitalleştirildi, bir PC’ye (Dell) kaydedildi ve özel MATLAB yazılımı (MathWorks) kullanılarak analiz edildi. Çözümler, çekim yazılımından kontrol edilen sekiz yollu bir manifold kıstırma valf sistemi (Nanion) kullanılarak kaydedilen hücreden yaklaşık 100 mm uzağa yerleştirilen bir kılcal tüp aracılığıyla yerçekimiyle beslenen bir perfüzyon sisteminden iletildi. Bu, yedi agonist konsantrasyonunun test edilmesine olanak sağladı. Agonist uygulamasının süresi, kanal için kararlı durum akım tepkisine ulaşmak için gereken süreyi belirlemek üzere pilot deneylere dayandırıldı. Harici çözelti (HEBSS) 140 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM glikoz, 4 mM KCl, 2 mM CaCl içeriyordu₂ ve 1 mM MgCl₂. Tam hücreli pipet iç çözeltisi 87 mM CsGlukonat, 31 mM CsCl, 5 mM NaCl, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA ve 3 mM MgATP içeriyordu. Osmolariteler 285–305 mOsm l aralığındaydı⁻¹ ve NaOH ile pH 7,3-7,4’e ayarlandı.

Kültürlenmiş hipokampal nöronların ve LHb akut beyin dilimlerinin elektrofizyolojisi

Deneyler ve prosedürler, hayvan testleri ve araştırmalarına ilişkin etik düzenlemelere uygundu ve Janelia Araştırma Kampüsü ile UCSD hayvan bakımı ve kullanımı komiteleri tarafından onaylandı. Hipokampal nöron kültürleri daha önce bildirilen bir yöntemin modifikasyonu ile hazırlandı.⁵⁸. Hipokampi, 100 U ml içeren HEPES tamponlu Hank çözeltisi içinde doğum sonrası 0. gün neonatal sıçan yavrularından (Charles River) parçalara ayrıldı.⁻¹ penisilin ve 10 μg ml⁻¹ streptomisin. Doku, 37 °C’de 30 dakika boyunca diseksiyon tamponunda papain (Worthington, PAP2) içerisinde ayrıştırıldı. Sindirimden sonra papain çıkarıldı ve doku, kaplama ortamında (MEM artı %10 fetal sığır serumu, 28 mM glikoz, 2,4 mM NaHCO) ayrıştırıldı.₃100 µg ml⁻¹ transferrin, 25 μg ml⁻¹ insülin, 2 mM ben-glutamin, 100 U ml⁻¹ penisilin ve 10 µg ml⁻¹ streptomisin). Hücre süspansiyonu 70 µm filtreden geçirildi ve 90°C’de santrifüj edildi.G 7 dakika boyunca Ortaya çıkan hücre topağı, kaplama ortamında yeniden süspanse edildi, sayıldı ve hücre canlılığı açısından test edildi.

pCAG::coca-GlyR-IRES-GFP veya pCAG::coca-5HT3-IRES-GFP plazmidleri, Lonza Nucleofector sistemi (P3 Primer Hücre 96-kuyu Kiti, Lonza) kullanılarak elektroporasyon yoluyla transfekte edildi, ardından hücreler poli- üzerine kaplandı.D– 24 oyuklu bir plakanın oyuklarında oyuk başına 50.000 hücre olacak şekilde lizin kaplı 13 mm çap #1 cam lamel. Her kuyucuğa 60 ul hücre süspansiyonu artı 60 ul NbActiv4 ortamı (BrainBits) alındı ​​ve %5 CO2 içerisinde 37°C’de inkübe edildi₂ İlk hücre eki için 4 saat boyunca. Daha sonra her bir oyuğa NbActiv4 ortamı (1 mi) ilave edildi ve kültürler, deney süresince muhafaza edildi. Haftalık ortam değişiklikleri, her bir kuyucuktan 0.5 ml ortamın taze NbActiv4 ile değiştirilmesiyle yapıldı.

Tam hücre kayıt dahili solüsyonu, 135 mM potasyum glukonat, 6,7 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,0 mM EGTA, 4,0 mM Na2ATP ve 0,3 mM Na3GTP içeriyordu. Osmolarite 285–305 mOsm l idi⁻¹ ve pH 7,3-7,4 arasındaydı. Tam hücre kayıt pipetlerinin uç direnci 1,5 ile 4 MΩ arasındaydı ve tam hücre seri direnci 6-29 MΩ (ortalama ± sem, 17,2 ± 0,6 MΩ) idi. Harici çözelti şunları içeriyordu: 140 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM glukoz, 4 mM KCl, 2 mM CaCl₂ ve 1 mM MgCl₂. Gerilim kelepçe modunda sıkı contalar (> 4 GΩ) yapıldı ve tüm hücre kayıt konfigürasyonunu oluşturmak için yama kesintisinden hemen sonra, Multiclamp Commander’da (Moleküler Cihazlar) kısa bir süre ‘I = 0’ moduna geçilerek dinlenme membran potansiyeli ölçüldü. Gerilim-kelepçe moduna geri döndükten sonra, diğer hücre zarı özellikleri, aynı cihazdaki otomatik hücre kapasitansı ve membran direnci dengeleme devresi kullanılarak ölçüldü. Seri direnç kompanzasyonu uygulanmadı. Akım kelepçesi kayıtları sırasında membran özellikleri, küçük akım enjeksiyonları (−20 pA, 200 ms, 1 Hz) ile izlendi. Aktivasyon eşikleri, sıralı olarak artan depolarize edici akım adımlarının (kokain tarafından kemogenetik reseptör aktivasyonuna bağlı olarak büyük bir şantın gözlenip gözlenmediğine bağlı olarak 5 pA veya 50 pA adımlar) enjeksiyonu yoluyla akım kelepçe modunda tahmin edildi. Eşik, ilk aksiyon potansiyelini indükleyen akım enjeksiyonunun genliği olarak ölçüldü.

Koka-5HT3’ün LHb nöronlarının pasif membran özellikleri üzerindeki etkilerinin analizi için, C57BL/6J farelerine (erkek, 4-5 haftalık) AAV5-Syn::coca-5HT3-IRES-mCherry (titre, 4 x 106) enjekte edildi.¹² ml başına viral genomlar (vg) veya bir kontrol virüsü AAV5-Syn::IRES-mCherry (titre: 2 x 106)¹² LHb’de (ml başına vg) (ön-arka (AP): bregmaya göre −1,55 mm; mediolateral (ML): +0,45 mm; dorsoventral (DV): −2,65 mm, −2,75 mm, −2,85 mm, her derinlikte 100 nl). 2-5 hafta sonra beyin dilimleri hazırlandı. Kısaca, hayvanlara izofluran ile derin anestezi uygulandı, başları kesildi ve beyinleri buz soğukluğunda kesit alma solüsyonunda çıkarıldı (aşağıda açıklanmıştır). Beyinler daha sonra Krazy Glue kullanılarak bir sahneye monte edildi ve soğutulmuş bir doku dilimleyici (Leica 1200S) kullanılarak koronal beyin dilimleri (250 um) kesildi. Dilimler, aşağıdakileri içeren, buz gibi soğuk, düşük sodyumlu, düşük kalsiyumlu bir çözelti içinde yapılmıştır: 135 mM N-metil-D-glukamin, 2,2 mM KCl, 20 mM NaHCO₃1,2 mM NaH₂PO₄10 mM glikoz, 0,25 mM CaCl2₂1,75 mM MgCl₂ ve 113 mM HC1 (%25 HCI çözeltisi, 6,85 M, 16,5 ml/1)⁻¹) daha sonra ihtiyaç duyulana kadar (30 dakika ila 5 saat) 1 mM askorbik asit ve 2 mM piruvik asit eklenmiş salin kaydında tutuldu. N-Metil-D-glukamin, sodyum ikamesi olarak kullanıldı. Dilimler cam tabanlı bir bölmede tutuldu, perfüze edildi ve kızılötesi gradyan kontrast optikleri kullanılarak dik bir Olympus BX-51 floresan mikroskobunun sahnesinde görüntülendi. Transfekte edilmiş nöronlar mCherry floresanslarıyla tanımlandı. Elektrofizyolojik kayıtlar, bir Multiclamp 200B amplifikatörü (Molecular Devices) ve satın alma için MATLAB Efus yazılımı kullanılarak tam hücre akım kelepçesi modunda yapıldı.⁵⁹. Veriler 4 kHz’de filtrelendi, National Instruments arayüz donanımı kullanılarak 10 kHz’de dijitalleştirildi ve bir PC’ye kaydedildi.

HEK293 hücrelerinde radyoligand bağlanma deneyleri

HEK293 hücreleri, koka-5HT3 veya koka-GlyR’yi (pcDNA3.1’de) kodlayan plazmidlerin tabak başına 5 ug’ı ile transfekte edildi ve transfeksiyondan 48 saat sonra toplandı. Hücreler, proteaz inhibitör kokteyli (1:100, Sigma-Aldrich) ile desteklenmiş Tris-HCl 50 mM pH 7.4 içerisinde süspanse edildi. HEK293 hücreleri, 6 Polytron homojenleştirici (Kinematica) ile parçalandı. Homojenatlar 48.000’de santrifüj edildiG (50 dakika, 4 °C) ve membran fraksiyonunu izole etmek için aynı koşullarda iki kez yıkandı. Protein, bisinkoninik asit yöntemi (Pierce) kullanılarak ölçüldü. Membran süspansiyonları (ml başına 50 ug protein), 8 mM CaCl2 içeren 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) içerisinde inkübe edildi₂2 nM [³H]ASMM (26⁻¹Novandi Chemistry) ve daha önce açıklandığı gibi oda sıcaklığında 2 saat boyunca test edilen bileşiklerin konsantrasyonlarının arttırılması¹². Spesifik olmayan bağlanma, 100 uM radyoaktif olarak etiketlenmemiş ASEM varlığında belirlendi. Serbest ve membrana bağlı radyoligandlar, 96 oyuklu bir plaka toplayıcıda (Brandel) 500 ul’lik alikotların hızlı filtrelenmesiyle ayrıldı ve 2 ml buz soğukluğunda Tris-HCl tamponu ile yıkandı. Filtre plakalarına Microscint-20 sintilasyon sıvısı (oyuk başına 65 ul, PerkinElmer) ilave edildi, plakalar gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi ve MicroBeta2 plaka sayacında (PerkinElmer) radyoaktivite sayımları %41 verimlilikle belirlendi. Prism 10 (GraphPad) kullanılarak iki bölgeli rekabet eğrileri yerleştirildi. k_Ben değerler Cheng-Prusoff denklemi kullanılarak hesaplandı.

Davranış deneyleri için hayvanlar

Deneyler ve prosedürler, hayvan testleri ve araştırmalarına ilişkin etik düzenlemelere uygundu, NIH yönergelerine uygundu ve NIDA hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylandı. Deneyciler grup tahsisine kördü. Sıçanlar, ters ışık döngüsünde (ışıklar 07:00 kapalı; ışıklar 19:00 açık) tek tek barındırıldı. Örneklem boyutları G*Power kullanılarak veya geçmiş çalışmalardan elde edilen deneyimlere dayanılarak tahmin edilmiştir.

Açık alan hareketi

Yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanlarına iki taraflı olarak (her tarafta 0,5 ul) AAV5 enjekte edildi–LHb’de Syn::coca-5HT3-IRES-mCherry (10° açı, bregmaya göre AP: −3,8 mm; ML, ±1,7 mm; DV, −5,2 mm) (N= 6) veya sahte ameliyata maruz bırakılmış (N= 6). Daha sonra, 4 hafta sonra, sıçanlar açık alanda hareket açısından değerlendirildi. Her sıçan şeffaf bir Pleksiglas kutuya (40 cm x 40 cm x 30 cm) yerleştirildi ve aktivite, 60 dakika boyunca kızılötesi ışın frenleri (Opto-varimex ATM3, Columbus Instruments) ile kaydedildi. Kat edilen mesafe, kontrol ve koka-5HT3 sıçanları arasında ortalama ± sem santimetre olarak çizildi.

Sükroz tercihi

Açık alanda lokomotor deneylerinde kullanılan sıçanlara, 1 gün boyunca işleme alışmaları için ev kafeslerinde iki şişe su verildi. Ertesi gün bir şişe, suda çözünmüş %1’lik sakaroz çözeltisiyle değiştirildi. 24 saat sonra tüketilen hacim ml cinsinden not edildi ve şişelerin konumu potansiyel yan tercihi kontrol edecek şekilde değiştirildi. 3. günde, konum değişiminden 24 saat sonra hem su hem de sükroz için tüketilen hacim hesaplandı. Bu hacim daha sonra kontrol ve koka-5HT3 sıçanları arasındaki ortalama ± sem tüketimi yüzdesi olarak çizildi.

Sükroz pelleti edimseli yanıt veriyor

Yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanlarına iki taraflı olarak (her tarafta 0,5 ul) AAV5 enjekte edildi– LHb’de Syn::coca-5HT3-IRES-mCherry (10° açı; bregmaya göre AP, −3,8 mm; ML, ±1,7 mm; DV, −5,2 mm) (N= 8) veya sahte ameliyata maruz bırakılmış (N = 5). Daha sonra, 4 hafta sonra, sıçanlar günde 18-20 g yemle sınırlandırıldı ve bir FR1 programında (7 gün boyunca günde 1 saat) 20 mg sakaroz peletleri için bir kola basmak üzere eğitildi. Seans sırasında yalnızca aktif kaldıraç uzatıldı. Bu kola basıldığında, 20 saniyelik işaret ışığı ve zaman aşımı eşliğinde bir pelet (Tozsuz Hassas Peletler, F07595, 20 mg, Sükroz; Bio-Serv) dağıtmak üzere yiyecek şarjörü etkinleştirildi. Mola süresi boyunca verilen yanıtlar kaydedildi ancak peletlerin dağıtılmasıyla sonuçlanmadı.

Dopamin seviyeleri

Sükroz tercih deneyindeki sıçanlara LHb’de (10° açı; AP göreceli olarak bregma, -3,8 mm; ML, ±1,7 mm; DV, -5,2 mm) AAV5-Syn::coca-5HT3-IRES-mCherry iki taraflı olarak enjekte edildi (yan başına 0,5 ul) (N = 6) veya sahte ameliyata maruz bırakılmış (N= 6). Daha sonra, 6 hafta sonra, sıçanlara ötenazi yapıldı ve beyin dokusu çıkarıldı ve izopentan içinde hızla donduruldu. Doku daha sonra parçalandı, koku alma soğanları çıkarıldı ve optik kiazmada koronal olarak kesitler alındı. Bilateral striatumu içeren doku daha sonra homojenleştirildi ve bir enzim bağlantılı immünosorbent tahlili (ELISA; Abcam, ab285238) kullanılarak dopamin seviyeleri açısından analiz edildi. Dopamin seviyeleri, kontrol ve koka-5HT3 sıçanları arasında mg başına ortalama ± sem pg olarak çizildi.

Kokain IVSA

Erkek Long Evans sıçanlarına izofluran (%1,5-2) ile anestezi uygulandı. Sıçanlar daha sonra stereotaksik bir çerçeveye (Kopf) yerleştirildi ve AAV vektörü AAV5-Syn::coca-5HT3-IRES-mCherry (0,5 ul, 4,95 x 106) enjekte edildi.¹²vg/ml) LHb’ye (bregmaya göre AP, −3,8 mm; ML, ±0,7 mm; DV, −5,25 mm, 10° açıda) (N= 11) veya sahte ameliyat geçirmiş (N = 15).

Yaklaşık 1 hafta sonra, sıçanlar, günlük uygulamalı seanslarda yiyecekleri kendi kendilerine idare edecek şekilde eğitildi. Yiyecek eğitimi için, sıçanlara günde dört büyük yem peleti verildi ve vücut ağırlığı günlük olarak izlendi. Sıçanlar 10 gün boyunca test edildi ve seanslar 3 saat sürdü. İlk 5 gün boyunca sıçanlar, sabit oranlı 1 (FR1) takviye programı kullanılarak test edildi ve ardından sonraki 5 gün için FR5 programına geçildi. Kolun her basılması, 45 mg’lık bir gıda peletinin (seans başına maksimum 200 pelet) verilmesine ve kolun üzerindeki bir işaret ışığının 1 saniye boyunca etkinleştirilmesine yol açtı. Her güçlendirilmiş kol basışını, kol tepkilerinin kaydedildiği ancak programlanmış sonuçların olmadığı 20 saniyelik bir zaman aşımı izledi.

Bu edimsel seansların ardından sıçanlara şah damarı kateterizasyonu için ameliyat uygulandı. Sıçanlara izofluran (%1,5-2) ile anestezi uygulandı. Modifiye edilmiş 22 kalibrelik bir kanüle (Plastics One, C313G-5up) bağlanan ve polipropilen ağ (Elko Filtering, 05–1000/45) ile yapıştırılan Silastik borudan yapılmış kateterler şah damarına yerleştirildi ve ağ, sıçanın orta kürek kemiği bölgesine sabitlendi. Sıçanlara ameliyattan sonra ve ertesi gün karprofen (kg başına 2.5 mg, deri altı, Norbrook) enjekte edildi. Sıçanlar, kendi kendine uygulama prosedürlerinden önce 6 gün boyunca iyileşti. Kateterler günlük olarak gentamisin (4.25 mg ml-) ile yıkandı.⁻¹ Fresenius Kabi, 1002) steril salinde çözüldü. Kateter yetmezliğinden şüpheleniliyorsa, kateter açıklığı kısa etkili barbitürat anestezik Brevital (metoheksital sodyum, 10 mg ml) ile test edildi.⁻¹ tamponlu salin içinde, 0,1–0,2 ml enjeksiyon hacmi, iv).

Yaklaşık 1 hafta sonra, sıçanlar günlük kokain IVSA edimsel eğitim seanslarına başladı. Sıçanlar, FR1 takviye programı kullanılarak test edildi ve ardından FR5 programına geçildi. Bu seanslarda, daha önce yiyecekle eşleştirilen kaldıraca verilen tepkinin programlanmış sonuçları (yani etkin olmayan kaldıraç) yoktu. Kokain eşleştirilmiş koluna (yani aktif koluna) verilen bir yanıt, kg başına 0,5 mg kokain dozunun (seans başına maksimum 60 infüzyon) infüzyonuna yol açtı ve aktif kolun üzerinde bulunan bir işaret ışığının 20 saniye boyunca (yani zaman aşımı süresi) aktivasyonuyla çakıştı. Bu süre zarfında kaldıraç tepkileri kaydedildi ancak programlanmış sonuçları olmadı. Kokain eğitiminin ardından sıçanlar, farklı kokain birim dozları (infüzyon başına kg başına 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 ve 1 mg) kullanılarak IVSA açısından test edildi. Prosedürler ilk seanslardakiyle aynıydı. Birim doz testinin sırası sıçanlar arasında rastgele seçilmiştir. Sıçanlar, kg başına 0,5 ve 1 mg birim dozlarda test edildiğinde maksimum 60 infüzyon gerçekleştirebildi ancak diğer birim dozlarda herhangi bir infüzyon sınırı mevcut değildi. İstatistiksel analizler Prism 10 (GraphPad) kullanılarak yapıldı.

PET analizi [¹⁸F]aldatıcı gurur

Erkek Sprague-Dawley sıçanlarına izofluran (%1,5-2) ile anestezi uygulandı ve daha sonra stereotaksik bir çerçeveye (Kopf) yerleştirildi ve AAV5-Syn::coca-5HT3-IRES-mCherry (0,5 ul, 4,95 x 106) enjekte edildi¹² vg/ml) LHb’ye (bregmaya göre AP, −3,8 mm; ML, ±0,7 mm; DV, −5,25 mm, 10° açıda) (N= 5) veya sahte ameliyat geçirmiş (N= 9). Erkek Bu–cresıçanlara izofluran (%1,5-2) ile anestezi uygulandı ve ardından stereotaksik bir çerçeveye (Kopf) yerleştirildi ve AAV1-Syn::FLEX-coca-GlyR-IRES-mCherry (0,5 ul, 6 x 106) enjekte edildi¹²vg/ml) VTA’ya (AP, bregmaya göre −6,0 mm; ML, ±1,9 mm; DV, 10° açıda −8,3 mm) (N= 9) veya sahte ameliyat geçirmiş (N= 6). Yaklaşık 3 hafta sonra, sıçanlara anestezi uygulandı ve PET tarayıcının (Mediso NanoScan PET/CT) içine yerleştirildi. [¹⁸F]fallypride (~13 MBq) ve ardından PET kullanılarak tarandı. [¹⁸F]fallypride, enjeksiyondan yaklaşık 45 dakika sonra kararlı duruma ulaşır ve ardından en az 150 dakika boyunca stabil kalır⁶⁰. Bu nedenle temel çizgiyi tanımladık [¹⁸F]Enjeksiyondan 60 ila 90 dakika sonra fallypride bağlanması ve ardından 90 dakika sonra hücre dışı dopaminde bir artış ortaya çıkarmak için [¹⁸F]fallypride enjeksiyonunun ardından farelere kokain (kg başına 3 mg, iv) enjekte ettik ve 30 dakika daha (90-120 dakika) taramaya devam ettik. PET verileri ölü zaman ve radyoaktif bozulma açısından yeniden yapılandırıldı ve düzeltildi ve daha sonra daha önce açıklandığı gibi bir manyetik rezonans görüntüleme şablonuna birlikte kaydedildi.^46,60,61. Birlikte kaydedilen görüntüler, tek yönlü ANOVA kullanılarak analiz edildi ve elde edilen parametrik görüntüler, istatistiksel olarak anlamlı olacak şekilde filtrelendi (P< 0,01) 100 bitişik vokselden daha büyük kümeler. Tüm istatistiksel parametrik haritalama (SPM) analizleri MATLAB R2016 (MathWorks) ve SPM12 (University College London) kullanılarak yapıldı.⁶². Daha sonra, PMOD yazılım ortamı (PMOD Technologies) kullanılarak PET görüntülerinin ek niceliksel değerlendirmeleri gerçekleştirildi. Birlikte kaydedilen dinamik PET görüntülerini ve ilgi hacmi olarak voksel bazında SPM analiziyle tanımlanan önemli voksel kümelerini kullanarak zaman-aktivite eğrileri oluşturduk. Standartlaştırılmış alım değeri (SUV), SUV = denklemi kullanılarak hesaplandı. C/(doz/BW) buradaCdoku konsantrasyonu [¹⁸F]sonbahar gururu (kBq cm⁻³ ), doz uygulanan dozdur (MBq) ve BW (kg) hayvanın vücut ağırlığıdır. İstatistiksel analizler Prism 10 (GraphPad) kullanılarak yapıldı.

Kokain uygulamasından sonra dopamin salınımının fiber fotometrisi

Erkek Sprague-Dawley sıçanlarına izofluran (%1,5-2) ile anestezi uygulandı ve daha sonra stereotaksik bir çerçeveye (Kopf) yerleştirildi ve AAV5-Syn::coca-5HT3-IRES-mCherry (0,5 ul, 4,95 x 106) enjekte edildi¹²vg/ml) LHb’ye (AP, bregmaya göre −3,8 mm; ML, ±0,7 mm; DV, −5,25 mm, 10° açıda) (N= 5) veya sahte ameliyat geçirmiş ( N= 6). Sıçanlara ayrıca, akümbens çekirdeğinin medial kabuğuna (AP, bregmaya göre +1,7 mm; ML, ±0,9 mm; DV, −7,0 mm) yönlendirilmiş 2,5 mm çaplı bir halkaya (Thorlabs) tutturulmuş bir optik fiber (400 µm çekirdek, 0,50 NA) implante edildi. AAV9-Syn::GRAB’ın olmasını sağlamak için_Da1m Fiber ucunun doğrudan yakınında transdüksiyon yapıldıktan sonra fiberi AAV (0,4 ul, 5 x 106) ile kapladık.¹²daha önce anlatıldığı gibi implantasyonundan önce ipek bir fibroin filmi kullanılarak ml başına vg)⁶³.

Fiber fotometrisi için dopamin (GRAB_VE) dinamikleri anestezi altındaki sıçanlarda Tucker-Davis Technologies (TDT) sistemi kullanılarak ölçüldü. Dopamin ve izosbestik sinyaller sırasıyla 465 (~40–50 μW) ve 405 nm (~20 μW) LED’ler tarafından uyarıldı. Veriler 1 kHz’de elde edildi. Test gününde sıçanlara anestezi uygulandı (izofluran: indüksiyon, %5; bakım, %3) ve bir fotometri yama kablosuna (400 μm çekirdek, 0,50 NA) bağlandı. YAKALAMAK_VE sinyaller daha sonra 5 dakika boyunca toplandı, ardından bir salin ip enjeksiyonu ve ek GRAB uygulandı_VE 20 dakika boyunca sinyal ölçümü. Daha sonra kokain kg başına 20, 10 veya 5 mg olacak şekilde ip olarak enjekte edildi ve GRAB_VE sinyal ilave 20 dakika boyunca ölçüldü. Her sıçan, rastgele sırayla uygulanan kokain dozlarıyla üç kez test edildi. Fiber fotometri analizleri, Barker () kodlarına dayanan MATLAB R2023b (MathWorks) içindeki komut dosyaları kullanılarak gerçekleştirildihttps://github.com/djamesbarker)⁶⁴ ve Lerner (https://github.com/talialerner/)⁶⁵ laboratuvarlar. Dopamin sinyali izosbestik sinyalle donatıldı [ΔF/F] ve bir şeye dönüştü zsıçanlar arasındaki dopamin sinyalinin karşılaştırılması için puan⁶⁴. GRAB_VE sinyal, salin veya kokain enjeksiyonundan 1 dakika önce değerlere normalleştirildi ve ortalama olarak gösterildiz-dakika başına puanlanan aktivite. Yüzdenin AUC’si ΔF/ FGRAB’ın_VE floresans, salin veya kokain enjeksiyonundan sonra 20 dakikalık bir kutuda hesaplandı. Fiber fotometri verileri ortalama ± sem olarak temsil edilir. İstatistiksel analizler Prism 10 (GraphPad) kullanılarak yapıldı.

İmmünohistokimya

Sıçanlara izofluran ile anestezi uygulandı ve transkardiyal olarak PBS ve ardından %4 PFA ile perfüze edildi. Beyinler gece boyunca 4 °C’de %4 PFA’da saklandı ve daha sonra 4 °C’de 3 ila 4 gün boyunca %30 sükroz içeren PBS’ye aktarıldı. Beyinler donduruldu ve bir kriyostat (30 μm ila 50 μm; Leica) üzerinde kesitlere ayrıldı ve dilimler PBS’de toplandı. İlk gün, kesitler oda sıcaklığında 30 dakika boyunca fizyolojik salinde %0,1 saponin ve %1 BSA ile bloke edildi ve spesifik antikorlarla inkübe edildi: sıçan monoklonal anti-mCherry (fizyolojik salinde %0,01 saponin ve %0,1 BSA ile seyreltilmiş 1:1,000, Invitrogen, M11217) veya tavuk poliklonal anti-GFP antikoru (1:2,000) fizyolojik salin içinde %0,01 saponin ve %1 BSA ile seyreltilmiş, Abcam, ab13970) gece boyunca 4 °C’de. Dilimler fizyolojik tuzlu suya batırıldı (oda sıcaklığında 5 dakika boyunca üç kez), daha sonra fizyolojik tuzlu suda çözünmüş %0,01 saponin ve %0,1 BSA’da ikincil bir antikorla inkübe edildi: keçi-anti sıçan immünoglobulin G (IgG) (H+L) çapraz emilmiş, Alexa Fluor 594 (1:500, Invitrogen, A11007) veya keçi-anti tavuk immünoglobulin Y (IgY) H&L (Alexa Fluor 488) (1:1,000, Abcam, ab150173) oda sıcaklığında (ışıktan korunarak) 2 saat süreyle. İkincil antikor inkübasyonunun ardından dilimler, fizyolojik salinle yıkandı (üç adet 5 dakikalık yıkama) ve ardından SuperFrost Plus Slaytlara yerleştirildi, Fluoromount-G ortamı (Southern Biotech) ile zıt boyandı ve lamel ile kapatıldı. Görüntüler, Leica DFC7000T kamerayla donatılmış bir Leica LMD6 mikroskobu kullanılarak çekildi ve LasX yazılımı kullanılarak işlendi.

İstatistikler

İstatistiksel analiz SigmaStat veya GraphPad Prism kullanılarak yapıldı. Uygun veya bağımsız olduğunda tekrarlanan ölçümleri dikkate alarak karma, iki yönlü veya üç yönlü ANOVA kullandık T-testler veya eşleştirilmiş örnekT-testler, metinde tanımlandığı gibi. İstatistiksel testler iki taraflıydı. Holm-Šidák çoklu karşılaştırma düzeltmesi kullanılarak post hoc testler yapıldı. Veriler ortalama ± sem olarak gösterilmiştir

Raporlama özeti

Araştırma tasarımına ilişkin daha fazla bilgi şu adreste mevcuttur:Doğa Portföyü Raporlama Özeti bu makaleye bağlı.