Fareler
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdDomates)/Hze/J (iTdTomato) (007914), C57BL/6J (CD45.2) (000664) ve B6.SJL-PtprcA PepcB/BoyJ (CD45.1) (002014) fareleri The Jackson Laboratory’den satın alındı. Nestin – GFP fareleri48 tesisimizde yetiştirildi. Cdh5-creER, Cdh2-creER, Cxcl12içeri/içeri, Kitliçeri/içeri, Tpo−/− ve Tg(Alb-Tpo) fareleri sırasıyla RH Adams, L. Li, T. Nagasawa, SJ Morrison, FJ de Sauvage ve WS Alexander tarafından sağlandı. Aksi belirtilmediği sürece, deneyler için her iki cinsiyetten 8-10 haftalık fareler kullanıldı. Tüm bu fareler, ondan fazla nesil boyunca C57BL/6J fareleri ile geri çaprazlandı ve patojen içermeyen koşullarda, 12 saat-12 saat aydınlık-karanlık döngüsünde, 21 ± 1 °C sıcaklıkta ve %40-70 nemde tutuldu ve otoklavlanmış yiyecek ve suyla beslendi. Bu çalışma, farelerle yapılan deneylere ilişkin tüm etik düzenlemelere uygundu ve fareler üzerinde gerçekleştirilen tüm deneysel prosedürler, Albert Einstein Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Deney gruplarını tahsis etmek için hiçbir rastgeleleştirme veya körleme kullanılmadı.
Femur kemiği nakli
Periosteumu sağlam olan femurlar, 8-10 haftalık donör farelerden izole edildi ve alıcı farelere implante edilene kadar PBS (21-040-CV, Corning) içerisinde buz üzerinde saklandı. Tek bir uyluk kemiğinin nakli için, yaş ve cinsiyet açısından donör farelerle eşleşen şartlandırılmamış alıcı farelere, ketamin ve ksilazin ile anestezi uygulandı ve bunların tek taraflı torasik bölgelerinde küçük bir kesi yapıldı. Daha sonra korunan uyluk kemiği deri altına implante edildi ve yara kapatıldı. Altı uyluk kemiği nakli için, alıcı farelerin iki taraflı servikal, torasik ve pelvik bölgelerinde küçük kesiler yapıldı ve ardından her bölgeye birer uyluk kemiği implantasyonu yapıldı ve ardından yara kapatıldı. Kontrol kemik nakli grubuyla aynı cilt bölgesinden küçük kesiler açılıp kapatılarak sahte operasyon yapıldı.
Parabiyoz
Parabiyontlar, farelerin karşıt taraflarında, dirsekten dizine kadar olan deride bir kesi yapılarak oluşturuldu. Dirsekler ve dizler sc dikişle birbirine eşleştirildi. Daha sonra deri bir fareden diğerine eşleştirildi, birbirine dikildi ve yara klipsleriyle sabitlendi.
Splenektomi
Farelere ketamin ve ksilazin ile anestezi uygulandıktan sonra, karnın sol dorsolateral tarafında, son kaburganın kaudalinde deride ve peritonda uzunlamasına bir kesi yapıldı. Splenik arter bağlandı ve dalak çıkarıldı. Daha sonra karın duvarı kapatıldı ve cilt dikildi. Dalağın dışarı çıkarılması ve ardından karın boşluğuna yeniden yerleştirilmesiyle sahte bir operasyon gerçekleştirildi.
İn vivo tedavi
G-CSF tedavisi için G-CSF (NEUPOGEN/Filgrastim; 300 µg ml−1Albert Einstein Tıp Fakültesi Jack D. Weiler Hastanesi’nden satın alınan) 125 μg kg- dozunda sc enjekte edildi.−1 İlk günün akşamından başlayarak günde iki kez (sekiz doza bölünmüş). Kemik nakli deneylerinde kullanıldığında, aksi belirtilmedikçe tüm gruplara femur implantasyonundan veya sahte operasyondan 1 ay sonra G-CSF uygulandı. HSC mobilizasyonu kontrol edildiğinde, son sabah dozundan 3 saat veya 7 gün sonra kan toplandı. CreER aracılı rekombinasyonun indüksiyonu için, 8-10 haftalık Cdh5-creER;iTdDomates Farelere, ardı ardına beş gün boyunca (fare başına toplam 10 mg) mısır yağı (C8267, Sigma-Aldrich) içinde eritilmiş 2 mg tamoksifen (T5648, Sigma-Aldrich) intraperitoneal olarak enjekte edildi. Daha sonra enjeksiyondan 4 hafta sonra bu fareler konakçı olarak kullanıldı veya uyluk kemikleri transplantasyon için izole edildi. Örtüşmeyi inceleyen deneylerde Cdh2+ hücreler ve MSC’ler, 8-10 haftalık Cdh2-creER;iTdDomates veya Cdh2-creER;iTdTomato;Nestin-GFP farelere tamoksifen enjekte edildi ve enjeksiyondan 4 hafta sonra analizlere tabi tutuldu. Kullanılarak yapılan deneylerde Cdh2-creER;Cxcl12içeri/içeri veya Cxcl12içeri/içeri Farelere konakçı olarak tamoksifen, uyluk kemiği implantasyonundan 2 ay sonra uygulandı veya bu farelere sahte bir operasyon yapıldı. Parabiyoz deneylerinde, parabiyontların her bir faresine, ameliyattan 3 hafta sonra art arda beş gün boyunca (parabiyoz başına toplam 20 mg) 2 mg tamoksifen enjekte edildi. Daha sonra enjeksiyondan 4 hafta sonra parabiyontlar analizlere tabi tutuldu. Kullanılarak yapılan deneylerde Cdh2-creER;Kitliçeri/içeri veya Kitliçeri/içeri Farelerin konakçı olarak kullanılmasının ardından dört ila beş haftalık farelere, uyluk kemiği implantasyonu yapılmadan veya sahte bir operasyon gerçekleştirilmeden önce tamoksifen uygulandı.
Konak femurlarının ve femoral greftlerin tam montajlı görüntülemesi
Femoral greftlerin ve konak femurların immünofloresan boyaması için kullanılan antikorlar, BioLegend’den CD31 (PECAM1) Alexa Fluor 647 (MEC13.3, 102516) ve CD144 (VE-cadherin) Alexa Fluor 647’dir (BV13, 138006). Tüm görüntüleme deneylerinde, bu antikorlar (her biri 5 μg), damar boyama için retro-orbital pleksus yoluyla farelere enjekte edildi ve farelere enjeksiyondan 10 dakika sonra ötenazi uygulandı. Femoral greftler ve konakçı femurlar daha sonra izole edildi ve gece boyunca 4 °C’de %4 paraformaldehit (PFA; 15710, Elektron Mikroskopi Bilimleri) içerisinde sabitlendi. Kriyoprezervasyon için kemikler, her biri 1 saat boyunca 4 °C’de sırasıyla %10, %20 ve %30 sükroz/PBS içerisinde inkübe edildi, gömüldü ve SCEM yerleştirme ortamına (C-EM002, SECTION-LAB) hızla donduruldu ve −80 °C’de saklandı. Tam montajlı görüntüleme için kemikler gece boyunca -20 °C’ye yerleştirildi ve BM boşluğu tamamen açığa çıkana kadar bir Cryostat (CM3050, Leica) ile tıraş edildi. Kesitler, eritme gömme ortamından dikkatlice toplandı, PBS ile durulandı ve 10 dakika boyunca% 4 soğuk PFA ile sabitlendi, ardından oda sıcaklığında (20-25 ° C) 3 saat boyunca% 0,5 Triton X-100 / PBS içerisinde geçirgenleştirme yapıldı ve 2 µg ml ile inkübasyon−1 4′,6-diamino-2-fenilindol (DAPI; D9542, Sigma-Aldrich) 30 dakika süreyle. Görüntüler, eş odaklı bir tarayıcı ünitesine (Yokogawa) sahip Zeiss Axio inceleme cihazı D1 mikroskobu (Zeiss) kullanılarak oda sıcaklığında elde edildi ve SlideBook 6 (Akıllı Görüntüleme Yenilikleri), Photoshop 26 (Adobe) ve ImageJ 2 (Ulusal Sağlık Enstitüsü, NIH) yazılımının Fiji yapısı ile üç boyutlu olarak yeniden yapılandırıldı.
Hücre hazırlığı
Konak femurlarındaki ve femoral greftlerdeki hematopoetik hücrelerin analizleri için, bu kemiklerdeki BM hücreleri, 21 kalibrelik bir iğne aracılığıyla PBS’li 1 ml’lik bir şırınga kullanılarak yıkandı ve ayrıştırıldı. Fare gövdesi boyunca hematopoetik hücrelerin analizleri için, endojen ve aşılanmış uyluk kemiği, kaval kemiği, omuz kemiği ve pelvisteki BM hücreleri, yıkama ve ayrıştırma yoluyla toplandı ve yarıçaplar, kafatası, omurga, göğüs kemiği ve kaburgalar, makasla küçük parçalar halinde kıyıldı, bir havan ve havan tokmağı ile ezildi ve 70 µm’lik bir hücre süzgecinden süzüldü. Dalak hücreleri, slayt camlarla hafifçe öğütülerek ve 70 um’lik bir hücre süzgecinden geçirilerek elde edildi. Karaciğerdeki hücreler, slayt camlarla hafifçe öğütülerek ve ardından 37 ° C’de 30 dakika boyunca 1 mg ml-1’de sindirim yoluyla elde edildi.−1 kollajenaz tip IV (17104019, Gibco), 2 mg ml−1 dispaz (17105041, Gibco) ve 50 μg ml−1 DNase I (DN25, Sigma-Aldrich). Periferik kan, izofluran ile anestezi uygulanan farelerin retro-orbital kanaması yoluyla toplandı ve pıhtılaşmayı önlemek için EDTA ile karıştırıldı. Yukarıdaki kemiklerden, dalaktan, karaciğerden ve kandan (hayvan başına 2 ml olduğu varsayılır) elde edilen veriler, fare gövdesindeki toplam HSC sayılarını belirlemek için toplandı. BM stromal hücrelerinin analizleri için, sağlam yıkanmış BM tıkaçları, 37 ° C’de 30 dakika boyunca 1 mg ml-1’de sindirildi.−1 kollajenaz tip IV, 2 mg ml−1 dağıtma ve 50 μg ml−1 Hank’in kalsiyum ve magnezyum içeren dengeli tuz çözeltisindeki DNaz I (21-023-CV, Gibco). Bu tek hücreli süspansiyonlar daha sonra amonyum klorür ile kırmızı kan hücresi parçalanmasına tabi tutuldu ve buz soğukluğunda PEB (%0,5 BSA ve 2 mM EDTA içeren PBS) içerisinde yıkandı.
Akış sitometri analizi ve hücre sıralama
Hücrelerin yüzeyi PEB’de 4 °C’de 30-60 dakika boyunca boyandı. Akış sitometri analizleri ve sıralaması için kullanılan antikorlar şu şekildeydi: anti-CD45 APC-eFluor 780 (30-F11, 47-0451-82), anti-TER-119 APC-eFluor 780 (TER-119, 45-5921-82), anti-CD31 PE-Cyanine7 (390, 25-0311-82), anti-CD51 biyotin (RMV-7, 13-0512-85), anti-CD140a (PDGFRA) PE (APA5, 12-1401-81), anti-CD140a PE-Siyanin7 (APA5, 25-1401-81), anti-Ly6A/E (SCA-1) FITC (D7, 11-5981-82), anti-Ly6G/Ly6C (GR-1) FITC (RB6-8C5, 11-5931-85), anti-Ly6G/Ly6C APC-eFluor 780 (RB6-8C5, 47-5931-82), anti-CD11b PE (M1/70, 12-0112-83), anti-CD11b PE-Cyanine7 (M1/70, 25-0112-82), anti-CD11b APC-eFluor 780 (M1/70, 47-0112-82), anti-B220 APC-eFluor 780 (RA3-6B2, 47-0452-82), anti-CD3e APC-eFluor 780 (145-2C11, 47-0031-82), anti-CD48 PerCP-eFluor 710 (HM48-1, 46-0481-85), anti-CD48 PE-Cyanine7 (HM48-1, 25-0481-80), anti-CD41 PerCP-eFluor 710 (MWReg30, 46-0411-82), anti-CD34 eFluor 660 (RAM34, 50-0341-82, 1:50 seyreltme), anti-CD135 (FLT3) PerCP-eFluor 710 (A2F10, 46-1351-82), anti-CD115 APC (AFS98, 17-1152-82) ve eBioscience’tan anti-CD45.1 PE-Cyanine7 (A20, 25-0453-82); BD Biosciences’tan anti-CD62E PE (10E9.6, 553751); anti-KIT PE-Cyanine7 (2B8, 105814), anti-CD117 Brilliant Violet 421 (2B8, 105828), anti-CD150 PE (TC15-12F12.2, 115904), F4/80 PE (BM8, 123110) ve anti-CD45.2 APC (104, 109814) BioLegend’den; ve Tonbo Biosciences’tan anti-CD3e PerCP-Cyanine5.5 (145-2C11, 65-0031-U100). Streptavidin FITC (11-4317-87) ve Streptavidin PerCP-eFluor 710 (46-4317-82), eBioscience’dan satın alınmıştır. Aksi belirtilmediği sürece tüm antikorlar, Streptavidin FITC ve Streptavidin PerCP-eFluor 710, 1:100 seyreltide kullanıldı. Akış sitometri analizleri BD LSRII (BD Biosciences) sistemi üzerinde gerçekleştirilmiş ve hücre sıralama deneyleri BD FACSAria (BD Biosciences) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ölü hücreler ve kalıntılar ileri dağılım, yan dağılım ve DAPI boyama (1 µg ml-1) ile hariç tutuldu−1) profiller. Veriler, FACS Diva 6.1 (BD Biosciences) ve FlowJo 10 yazılımı kullanılarak analiz edildi. Geçitleme stratejileri Ek Şekil 2’de gösterilmektedir. 1.
Hücre döngüsü analizi
Tek hücreli süspansiyonlar, hücre yüzeyi işaretleyicileri için boyandı ve ardından üreticinin talimatlarına göre BD Cytofix/Cytoperm çözeltisi (554714, BD Biosciences) ile sabitlendi ve geçirgenleştirildi. Hücreler daha sonra 5 μg ml-1’de DAPI (Sigma-Aldrich) ile boyandı.−1 ve anti-Ki-67 PerCP eFluor 710 antikoru (SolA15, 46-5698-80, eBioscience) veya anti-Ki-67 eFluor 660 antikoru (SolA15, 50-5698-82, eBioscience), 4 °C’de 30 dakika boyunca 1:100 seyreltmede. Yıkandıktan sonra hücreler BD LSRII (BD Biosciences) sisteminde analiz edildi. Bir DAPIDüşükKi-67Düşük fraksiyonu hücre döngüsünün G0 fazı olarak belirlendi.
Kan hücresi analizi
Periferik kan PBS’de seyreltildi ve kan parametreleri Advia120 Hematoloji Sistemi (Siemens) ile belirlendi.
Rekabetçi BM ve HSC nakli
Rekabetçi yeniden popülasyon analizleri, CD45.1/CD45.2 kongenik sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. CD45.1 alıcı fareler, bir sezyum mark 1 ışınlayıcıda (JL Shepherd & Associates) öldürücü derecede ışınlandı (12 Gy, en az üç saat arayla iki bölünmüş doz). BM yeniden popülasyon deneyleri için 1 × 106 CD45.2 donör çekirdekli BM hücreleri, 1 x 106 ile birlikte ışınlanmış alıcılara nakledildi6 CD45.1 BM hücreleri. HSC yeniden popülasyonlandırma analizleri için, BM hücrelerinden 200 HSC (CD45.2) ayrıldı ve 200 HSC (1:1 HSC oranı) içerdiği hesaplanan CD45.1 rakip BM hücreleriyle birlikte ışınlanmış CD45.1 alıcılarına nakledildi. İkincil BMT için, 3 × 106 Birincil alıcı farelerden alınan BM hücreleri, yeni ışınlanmış (12 Gy) CD45.1 alıcılarına nakledildi. Miyeloidin CD45.1/CD45.2 kimerizmi (CD11b)+), B (B220+) ve T (CD3ε+) alıcı kanındaki soylar, bir akış sitometresi kullanılarak BM veya HSC transplantasyonundan sonra 5 aya kadar analiz edildi ve BM hücrelerininki, farelere ötenazi yapılan BM veya HSC transplantasyonundan 5 ay sonra kontrol edildi.
Ex vivo HSC kültürü
Ex vivo HSC kültürleri, daha önce tarif edildiği gibi F12-PVA bazlı kültür koşulları kullanılarak gerçekleştirildi.40. Kısaca, HSC’ler 200 ul HSC ortamı içeren 96 oyuklu düz tabanlı plakalara ayrıldı ve 37 °C’de %5 CO2 ile genişletildi2 28 güne kadar. Ortam değişiklikleri 2-3 günde bir yapıldı. Hücreler %80-90 birleşme oranına ulaşıldığında 1:3 oranında yeni plakalara bölündü. Genişlemenin ardından hücreler koşulsuz transplantasyon için kullanıldı.
Koşulsuz HSPC nakli
HSC’ler CD45.2 farelerinden saflaştırıldı ve yukarıda açıklandığı gibi genişletildi. Genişletilmiş HSPC’ler (106 Alıcı fare başına LSK hücreleri) daha sonra ışınlanmamış tamoksifen uygulanan farelere aktarıldı. Cdh2-creER;Kitliçeri/içeri Bir veya altı WT femurunun transplantasyonundan sonra fareler (10 nesilden fazla CD45.2 farelerle çaprazlanmış), ardışık günler boyunca üç doza bölünmüş.
Hedeflenen uzuv ışınlaması
Küçük Hayvan Radyasyon Araştırma Platformu SARRP (XStrahl) kullanılarak ışınlama öncesinde hayvanlara izofluran ile anestezi uygulandı. Ortovoltajlı X-ışını ünitesi 220 kVp ve 13 mA’da çalışır. Işınlamadan önce, Al filtreli 50 kVp ve 0,7 mA tüp akımı kullanılarak statik bir X-ışını taraması elde edildi. Fareler, tüm vücut kurşun korumalı (bireyselleştirilmiş bölmeleri istenmeyen ışınlamadan korumak için) ve içinden dört uzuvun çıkıntı yaptığı ve tek bir fraksiyonda 20 Gy’ye kadar ışınlanmış sabitlenmiş portların bulunduğu dairesel bir lusit jig içinde tutuldu.
RNA ekstraksiyonu ve RT – qPCR analizi
Toplam 2 × 103 MSC’ler veya HSC’ler doğrudan lizis tamponuna ayrıldı ve -80 °C’de saklandı. mRNA, üreticinin protokollerine göre Dynabeads mRNA DIRECT Purification Kit (61012, Invitrogen) kullanılarak ekstre edildi. Daha sonra, üreticinin talimatlarına uygun olarak RNA’dan cDNA EcoDry Premix’e (639549, TaKaRa) kullanılarak rastgele heksanükleotit primerleri ile geleneksel ters transkripsiyon (RT) gerçekleştirildi. Kantitatif PCR (qPCR), QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System v.1.7.2 (Applied Biosystems) üzerinde FastStart Universal SYBR Green Master Mix (04913914001, Roche) ile 384 oyuklu plakalarda gerçekleştirildi. PCR protokolü 95 °C’de (10 dakika) bir döngü ile başladı ve 95 °C’de (15 saniye) ve 60 °C’de (1 dakika) 40 döngü ile devam etti. Tüm mRNA bolluğu karşılık gelen miktara göre hesaplandı. Actb (β-aktin kodlayan) Δ kullanarakCT Yöntem. Primer dizilerinin bir listesi Ek Tabloda verilmiştir. 1.
ELISA
BMEF analizi için bir femur veya pelvisin BM’si 1 ml PBS kullanılarak yıkandı ve hücreler daha sonra santrifüjleme yoluyla topaklandı. Elde edilen süpernatan başka bir tüpe aktarıldı ve analize kadar -80 °C’de saklandı. Serum analizi için kanın oda sıcaklığında pıhtılaşmasına izin verildi ve serum santrifüjleme yoluyla ayrıldı ve analize kadar -80 °C’de saklandı. BMEF ve serumdaki sitokin seviyeleri daha sonra üreticinin talimatlarına göre fare IL-1β (BMS6002), IL-6 (KMC0061) ELISA kitleri (Thermo Fisher Scientific) ve TNF (MTA00B-1), CXCL12/SDF-1α (MCX120), SCF (MCK00) ve TPO (MTP00) Quantikine ELISA kitleri (R&D Systems) kullanılarak ölçüldü. protokoller.
İstatistik ve tekrarlanabilirlik
Tüm veriler ortalama ± sem olarak sunulmuştur. N şekil açıklamalarında ayrıntılı olarak açıklandığı gibi her deneydeki fare sayısını temsil eder ve sunulan deneyler en az üç biyolojik kopyada başarıyla çoğaltılmıştır. Numune boyutlarını önceden belirlemek için herhangi bir istatistiksel yöntem kullanılmamıştır ve numune boyutları, laboratuvarımızda gerçekleştirilen önceki deneylerde gösterildiği gibi benzer hematopoez modelleriyle ilgili önceki deneyimlere göre belirlenmiştir.13,14,16,19,20,47. Numunenin hariç tutulması yalnızca farenin erken ölümünün bir sonucu olarak yapıldı. İstatistiksel anlamlılık, eşleştirilmemiş, iki kuyruklu bir Öğrencinin T– iki grubu karşılaştırmak için test veya tek yönlü bir ANOVA ile çoklu grup karşılaştırmaları için Tukey’in çoklu karşılaştırma testleri. Veri sunumu ve istatistiksel analizler Prism 10 (GraphPad), Excel 16 (Microsoft), SlideBook 6 (Intelligent Imaging Innovations), Photoshop 26 (Adobe) ve FlowJo 10 yazılımı kullanılarak yapıldı.
Şekil 2’deki veriler. 2j,k aynı deneylerde elde edildi ve sahte olarak çalıştırılan farelerden elde edilen veriler bu şekil panellerinin her birinde yeniden kullanıldı. Genişletilmiş Verilerdeki veriler Şek. 7b,c aynı deneylerde elde edildi ve sahte olarak çalıştırılan farelerden elde edilen veriler bu şekil panellerinin her birinde yeniden kullanıldı. Genişletilmiş Verilerdeki veriler Şek. 8i,j aynı deneylerde elde edildi ve sahte operasyonlardan elde edilen veriler Cxcl12içeri/içeri Ve Cdh2-creER;Cxcl12içeri/içeri Bu şekil panellerinin her birinde fareler yeniden kullanıldı. Şekil 2’deki veriler. 3 saat, ben aynı deneylerde elde edildi ve sahte operasyonlardan elde edilen veriler Cxcl12içeri/içeri Ve Cdh2-creER;Cxcl12içeri/içeri Bu şekil panellerinin her birinde fareler yeniden kullanıldı. Şekil 2’deki veriler. 4c,d aynı deneylerde elde edildi ve sahte operasyonlardan elde edilen veriler Kitliçeri/içeri Ve Cdh2-creER;Kitliçeri/içeri Bu şekil panellerinin her birinde fareler yeniden kullanıldı. Şekil 2’deki veriler. 5c, d aynı deneylerde elde edildi ve sahte operasyonlardan elde edilen veriler Tpo+/+, Tpo+/− Ve Tpo−/− Bu şekil panellerinin her birinde fareler yeniden kullanıldı. Şekil 2’deki veriler. 5 saat, ben aynı deneylerde elde edildi ve sahte olarak çalıştırılan WT’den veriler ve Tpo-Tg fareleri bu şekil panellerinin her birinde yeniden kullanıldı.
Raporlama özeti
Araştırma tasarımına ilişkin daha fazla bilgi şu adreste mevcuttur:Doğa Portföyü Raporlama Özeti bu makaleye bağlı.
News
