BindCraft ile fonksiyonel protein bağlayıcıların tek seferde tasarımı

BindCraft tasarım protokolü

BindCraft işlem hattını çalıştırmaya yönelik giriş ve tasarım ayarları, kullanıcı dostu JSON dosyaları halinde düzenlenmiştir. Tasarım yörüngelerini başlatmak için, bağlayıcıların istenen minimum ve maksimum uzunluğu ve istenen son filtrelenmiş tasarım sayısıyla birlikte hedef PDB format yapısının belirtilmesi gerekir. Bir hedef sıcak nokta, tek tek kalıntılar veya tüm zincirler olarak belirlenebilir veya tamamen ihmal edilebilir; bu durumda, birleşik tasarım kaybına göre bir bağlanma alanı seçilir.

Bağlayıcı halüsinasyon işlemi, AF2’nin ColabDesign uygulaması kullanılarak gerçekleştirilir. Tasarım süreci, tek sıra modunda tahmin edilen bağlayıcı için rastgele bir sıra ve hedef için yapısal bir girdi şablonu ile başlatılır. Bu, bir yapı tahmini elde etmek ve tasarım kaybını hesaplamak için AF2 ağından geçirilir. Tasarım kaybı fonksiyonu, varsayılan ağırlık değerlerinin parantez içinde gösterildiği birkaç terimden oluşur:

1. (1)

   bağlayıcı güvenirliği pLDDT (ağırlık 0,1)

   
2. (2)

   arayüz güveni i_pTM (ağırlık 0,05)

3. (3)

   Bağlayıcı içindeki normalize edilmiş tahmini hizalama hatası (pAE) (ağırlık 0,4)

   

4. (4)

   Bağlayıcı ve hedef arasında normalleştirilmiş öngörülen hizalama hatası (pAE) (ağırlık 0,1)

5. (5)

   Bağlayıcı içinde kalıntı temas kaybı (ağırlık 1,0)

6. (6)

   Hedef ve bağlayıcı arasında kalıntı temas kaybı: sıcak noktalar belirtilirse hedefin geri kalanı bu kayıptan maskelenir (ağırlık 1,0)

7. (7)

   bağlayıcının dönme yarıçapı (ağırlık 0,3)

8. (8)

   ‘sarmallık kaybı’: sarmal veya sarmal olmayan tasarımların halüsinasyonunu teşvik etmek için omurga temaslarını her biri üç kalıntılı bir ofsetle cezalandırın veya teşvik edin (ağırlık −0,3)

9. (9)

   isteğe bağlı ‘N&C termini kaybı’, protein döngülerine eklemeye izin vermek için bağlayıcının N ve C terminallerinin yakınlığını arttırır (ağırlık 0,1).

Kayıp fonksiyonu, konuma özgü hataları hesaplamak için kullanılır; bunlar daha sonra AF2 ağı üzerinden geriye yayılarak bir sonuç üretir. L × 20 hata gradyanı, burada Ldizi uzunluğudur. Çoklu yinelemeler ve stokastik gradyan iniş optimizasyonu kullanılarak, bu hata gradyanı yeniden hesaplanır ve ortaya çıkan kaybı en aza indirmek amacıyla bir sonraki yineleme için girdi bağlayıcı dizisini optimize etmek için kullanılır. AF2 multimer model ağırlıkları aracılığıyla geriye yayılım yapıyoruz¹¹ ve sağlam dizi oluşturmayı sağlamak ve tek bir modele aşırı uyum riskini azaltmak için her yinelemede beş eğitilmiş model arasında rastgele geçiş yapın.

Amacımız bağlanma arayüzü için gerçek bir ayrık diziye ulaşmak olduğundan, dizi optimizasyonu dört aşamada gerçekleştirilir. İlk dizi optimizasyon aşaması, logit girdileri kullanılarak sürekli bir dizi uzayında gerçekleştirilir. Her adımda dizi gösterimi (1 −ben) × logitler + ben× softmax(logitler/T), Neresiben = (adım + 1)/yinelemeler ve sıcaklık ( T ) 1,0. Burada, her bir bağlayıcı konumu başına birçok amino asit dikkate alınır; bu, daha büyük ve daha az kısıtlı bir dizi yapısı alanının araştırılmasına olanak tanır. 50 yinelemeden sonra, zayıf AF2 güven puanlarını gösteren yörüngeleri sonlandırıyoruz, çünkü bu tür yörüngelerin nadiren yüksek güvenirlik tasarımlarına yakınsadığını gördük. Ayrıca, beta sayfalı bir yörünge tespit edilirse, doğru tahmin sağlamak için tasarım sırasındaki geri dönüşüm sayısını birden üçe çıkarıyoruz. Sürekli dizi alanı optimizasyonu daha sonra 25 yineleme daha sürdürülür. İkinci optimizasyon aşaması sırasında, tasarım alanını softmax(logits/ T) Her adımda sıcaklık düşürülür, burada sıcaklık (1 × 10⁻²+ (1 − 1 × 10⁻²) × (1 − (adım + 1)/yinelemeler)² ). Sıcaklık aynı zamanda hız azalmasına yönelik öğrenme oranını ölçeklendirmek için de kullanılır. Üçüncü aşama için, modelin tek sıcak gösterimi görmesine, ancak softmax gösterimi yoluyla geri yayılım yapmasına olanak tanıyan düz tahminciyi uyguluyoruz. Bu prosedür beş yineleme için gerçekleştirilir. Son dördüncü aşamada, dizi girişleri tek-sıcak ayrık kodlamaya dönüştürülür. Her adımda,XRastgele mutasyonlar, önceki aşamadaki softmax temsilinin olasılık dağılımından bağımsız olarak örneklenir ve test edilir ve en iyi kayba sahip mutasyonlar sabitlenir.X bağlayıcı dizisinin uzunluğu (0,05× bağlayıcı uzunluğu) temel alınarak tanımlanır. Bu prosedür 15 tekrar için gerçekleştirilir. Sonunda, pLDDT’nin 0,7’nin altında olduğu, 7’den az arayüz bağlantısının olduğu veya önemli omurga çakışmalarının olduğu yörüngeler reddedilir.

Başarılı ciltleyici tasarım yörüngeleri MPNN’ye tabi tutulur_sol Kararlılığı ve çözünürlüğü artırmak için dizi optimizasyonu¹². Bu amaçla, hedef arayüzün etrafındaki 4 Å yarıçapındaki bağlayıcı kalıntılarını koruyoruz ve ProteinMPNN’nin çözünebilir ağırlıklarını kullanarak kalan bağlayıcı çekirdek ve yüzey kalıntıları için 20 yeni dizi tasarlıyoruz.⁶0,1 sıcaklıkta ve 0,0 omurga gürültüsünde. Bu optimize edilmiş diziler daha sonra üç geri dönüşüm ve iki şablon tabanlı modelle AF2 monomer modeli kullanılarak yeniden tahmin edilir.⁴⁹ Sağlam ve tarafsız karmaşık değerlendirme sağlamak için tek sıralı modda. Ortaya çıkan iki modelin her birinin enerjisi Rosetta’nın FastRelax protokolü kullanılarak en aza indirilir.⁵² 200 yineleme ile arayüz puanları, InterfaceAnalyzer taşıyıcı kullanılarak hesaplanır⁵³ yan zincir ve omurga hareketi etkinleştirilmiş.

Deneysel testler için yüksek kaliteli tasarımların seçilmesini sağlamak amacıyla tasarımlar son olarak önceden tanımlanmış bir dizi filtre kullanılarak filtrelenir. Filtreler başlangıçta önceki bağlayıcı tasarım çalışmalarından elde edilen deneysel gözlemlere dayanarak tanımlandı.^2,3,4,5 ve bu çalışma boyunca geliştirildi. Bunlar şunları içerir:

1. (1)

   Öngörülen kompleksin AF2 güven pLDDT puanı (>0,8)

2. (2)

   AF2 arayüzü tahmin edilen güven puanı (i_pTM) (>0,5)

3. (3)

   AF2 arayüzü tahmin edilen hizalama hatası (i_pAE) (<0,35)

4. (4)

   Rosetta arayüz şekli tamamlayıcılığı (>0,60)

5. (5)

   arayüzdeki hidrojen bağlarının sayısı (>3)

6. (6)

   arayüzdeki doymamış hidrojen bağlarının sayısı (<4)

7. (7)

   bağlayıcı yüzeyinin hidrofobikliği (<%35)

8. (8)

   Bağlı ve bağlanmamış formda tahmin edilen bağlayıcı rmsd’si (<3,5 Å)

9. (9)

   Bağlayıcı arayüzünde üçten az lizin ve metionin bulunur.

Yalnızca iki MPNN’e izin veriyoruz_sol Seçilen bağlayıcılar arasında arayüz çeşitliliğini teşvik etmek amacıyla filtreleri geçirmek için bireysel AF2 yörüngesi başına oluşturulan diziler. Bu tasarım prosedürü, tanımlanmış sayıda nihai istenen tasarıma ulaşılıncaya kadar döngü halinde ayarlanır. En iyi sonuçları elde etmek için, tasarım hattını en az 100 tasarım hesaplama filtrelerini geçene kadar çalıştırmanızı öneririz. Bu genellikle yaklaşık 300-3.000 yörüngenin örneklenmesini gerektirir. Daha sonra deneysel testler için genellikle ilk 20’den (i_pTM’ye göre sıralanmış) 10 tasarım seçeriz.

‘De novo bağlayıcıların doğru tasarımı’ bölümünde açıklanan hedeflere yönelik tasarımlar oluşturmak için Ek Tabloda açıklanan girdi yapılarını, bağlayıcı spesifikasyonlarını ve sıcak nokta tanımlamalarını kullandık. 1. AF2 tahminleri için UniProt’un tam uzunluktaki giriş dizilerini kullandık. Her durumda amino asit sistein dizi tasarımının dışında bırakıldı. AAV hedefleri için N terminali ve C terminali kaybı varsayılan ağırlıkla etkinleştirilir.

BindCraft’ın hesaplamalı kriterleri

Hedef yapının tasarım sonrası esnekliğini değerlendirmek için hedefin giriş PDB yapısı, tasarım yörüngesinin hedef zinciri A ile hizalandı ve rmsd_Ca PyRosetta kullanılarak hesaplandı. Hedef esnekliğini artırmak amacıyla, girdi hedefi şablonunun sırası, yörünge halüsinasyonu için ColabDesign’da ‘rm_target_seq’ bayrağı etkinleştirilerek maskelendi.⁵⁴ve 200 yörünge oluşturuldu.

Helisite kaybının bağlayıcı ikincil yapı bileşimi üzerindeki etkisi için BindCraft’taki ‘weights_helicity’ bayrağı 1, 0, −0,3, −1, −2 ve −3 olarak ayarlandı ve aksi takdirde varsayılan ayarlar kullanılarak her örnek için 200 yörünge oluşturuldu.

AF2 monomer ve multimer ağırlıklarının tasarım yeteneklerini karşılaştırmak için her biri 200 yörünge oluşturduk. AF2 multimer yörüngeleri için, tasarım için AF2 multimer modellerinin 1-5 kullanıldığı ve şablonlarla eğitilmiş AF2 monomer modellerinin 1-2 çoğaltma için kullanıldığı varsayılan ayarları kullandık. AF2 monomeri için bu tersine çevrilir; tasarım için AF2 monomer modelleri 1 ve 2’yi ve çoğaltma için AF2 multimer modelleri 1-5’i kullanırız.

Tasarım ve yörünge başarı oranlarını içeren kıyaslamalar için, tasarım hattını ya 200 yörünge için ya da silico filtrelerden geçen 100 tasarım toplanana kadar (belirtildiği yerde) çalıştırıyoruz. Daha sonra pLDDT’si 0,7’nin üzerinde olan yörüngeleri ‘geçen’ olarak belirlerken, pLDDT’si 0,7’nin altında olan, zincirler arasında 1’den fazla Cα omurga çatışması veya bağlayıcı ile hedef arasında 3’ten az temas bulunan yörüngeler ‘düşük güven’ olarak tanımlanır.

RF difüzyon kıyaslamaları orijinal yayında açıklandığı gibi gerçekleştirildi⁵İşlem hattının izleme amacıyla deterministik modda çalıştırılması haricinde. Kısaca, belirlenen uzunluklardaki omurgalar, seçilen hedeflere karşı RF difüzyon kullanılarak örneklendi ve diziler, 0,0001 sıcaklığa sahip orijinal ProteinMPNN ağırlıkları ve omurga başına 8 dizi kullanılarak tasarlandı. Her kompleks, AF2 monomer modeli 1 kullanılarak tahmin edildi ve her omurga için iki MPNN tasarımlı sekansın, orijinal yayında tanımlandığı gibi filtreleri geçmesine izin verildi (pLDDT > 0,8, i_pAE < 0,32, bağlayıcı rmsd < 1,0 Å). Boru hattı, 100 tasarım filtreleri geçene kadar çalıştırıldı. Hesaplama süresi, her tasarım için omurga oluşturma süresi + ProteinMPNN dizi oluşturma + AF2 kompleksi tahmini olarak hesaplandı. Özellikle, RF difüzyon durumunda tek model tahmini kullanılmış olmasına rağmen, BindCraft durumunda iki şablon tabanlı AF2 modelini kullanarak tahmin kullandık.

Ek Verilerdeki hedefler ve bağlayıcılar arasında ikili yapısal benzerlikler ve dizi kimlikleri2 Foldseek kullanılarak çıkarıldı⁵⁵ kapsamlı arama ve TMalign hizalama türü.

Tasarlanan bağlayıcı komplekslerin katlama ve arayüz yeniliğini belirlemek için, TMalign modunda Foldseek’i kullanarak bağlayıcı zincirini PDB’ye göre araştırdık. Her bir bağlayıcı için en yüksek şablon modelleme puanına (qtmscore) ve sıra kimliklerine (fident) sahip isabetler çizildi. Foldseek’teki düşük çözünürlüklü yapısal gösterimler nedeniyle arayüz yeniliğini değerlendirmek için alternatif bir strateji kullanıldı. Kalıntılar, tasarlanan arayüzün etrafında 6 Å yarıçapında PPIRef kullanılarak çıkarıldı, daha sonra varsayılan eşik değeri 0,04 olan iDist yöntemi kullanılarak önceden hesaplanmış PDB etkileşim çiftlerine karşı arandı (ref. ¹⁴). Daha sonra en yakın arayüz isabeti, şablon modelleme puanını ve dizi kimliğini hesaplamak için USalign kullanılarak hizalanır.¹⁵.

Diğer tasarım boru hatlarından tasarımların karşılaştırılması, AF2 monomerinin veya multimerinin tek sıra halinde BindCraft tahmin yöntemi kullanılarak, ilgili yayınlardaki spesifikasyonlara göre hedef için sağlanan şablonlar kullanılarak gerçekleştirildi.

Tasarlanan BindCraft komplekslerinin AlphaFold3 tahminleri, AlphaFold3 sunucusu kullanılarak gerçekleştirildi.⁴⁹ çoklu sıralı hizalamalar ve şablonlar etkinken.

İkili Pearson korelasyon katsayıları ( R ) deneysel bağlanma arasında (evet, 1, hayır, 0), Afinite (nanomolar, uzunluk ve tüm AF2 ve Rosetta’dan türetilmiş özellikler hesaplandı ve tüm değer çiftleri arasındaki doğrusal ilişkileri ve korelasyonu değerlendirmek için bir ısı haritası olarak görselleştirildi. Hücrelerde belirtilen katsayı değerleri, | R | ≥ 0,7.

Protein ekspresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu

Tasarlanan proteinlerin DNA dizilerinin yanı sıra BBF-14, Der f7, Der f21 ve Bet v1 hedefleri, bakteriyel ekspresyon vektörleri pET21b veya pET11’e klonlamak için Gibson klonlama adaptörleriyle Twist Biosciences’tan sipariş edildi. Proteinler ifade edildi Escherichia coliBL21 Codon Plus (DE3) hücreleri (Novagen), 0,5 mM izopropil-β- ile indüklenerekD-tiyogalaktozid 18°C’de 6 saat süreyle. Peletler yeniden süspanse edildi ve lizis tamponu (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, %5 gliserol, 1 mg ml-) içinde eritildi⁻¹ lizozim, 1 mg ml⁻¹ fenilmetilsülfonil florür ve 1 µg ml⁻¹DNaz) sonikasyon kullanarak. Hücre lizatları, ultrasantrifüjleme kullanılarak arıtıldı, 1 ml Ni-NTA Superflow kolonuna (Qiagen) yüklendi ve 7 kolon hacminde 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl ve 10 mM imidazol ile yıkandı. Proteinler, 10 sütun hacminde 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol ile elüt edildi. Claudin bağlayıcıları 20 mM HEPES pH 8.0, 150 mM NaCl, %4 gliserol’e karşı diyalize tabi tutuldu ve doğrudan donduruldu.

Fc ile kaynaşmış PD-L1 hedefi³IFNAR2 hedefi, IFNA2 sitokini ve antikorlar, bir memeli Expi293 salgılanan ekspresyon sistemi (Thermo Fisher Scientific, A14635) kullanılarak eksprese edildi. Transfeksiyondan altı gün sonra süpernatanlar, 1 ml Ni-NTA Superflow kolonu (Qiagen) veya protein A afinite kolonu (Qiagen) kullanılarak toplandı, temizlendi ve saflaştırıldı. SAS-6 (bkz. ²²), SpCas9 (ref. ⁵⁶), CbAgo ve CbAgo’nun katalitik mutantı (D541A, D611A)⁴⁰ daha önce açıklandığı gibi saflaştırıldı.

Geriye kalan bakteriyel ve memelilerde eksprese edilen proteinler daha sonra konsantre edildi ve 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM KCl veya PBS içindeki bir Superdex 75 16/600 veya Superdex 75 10/300 jel filtrasyon kolonuna (GE Healthcare) enjekte edildi. Boyut dışlamasından sonra proteinler konsantre edildi, sıvı nitrojen içinde donduruldu ve -80 °C’de saklandı. Molar kütle, numune homojenliği ve multimerik durum, PBS’ye (Column, Superdex 75 10/300 veya Superdex 200 10/300, GE Healthcare) 100 µg protein enjekte edilerek SEC-MALS (miniDAWN TREOS, Wyatt) kullanılarak doğrulandı. Katlanma, ikincil yapı içeriği ve erime sıcaklıkları, 0,1-0,3 mg ml- konsantrasyonunda PBS’deki Applied Photophysics’ten bir Chirascan V100 cihazında dairesel dikroizm kullanılarak değerlendirildi.⁻¹ .

PD-1 hedefi ve bağlayıcıların ekspresyonu ve saflaştırılması

DNA dizileri, N terminalinde (Twist Biosciences) bir osteonektin salgılama sinyali ile pcDNA3.4 vektöründe sentezlendi. De novo tasarımlar insan IgG1 Fc’nin N terminaline kaynaştırıldı. İnsan PD-1’in (UniProtKB) hücre dışı alanı (25-167) Q15116) bir C terminali AviTag ve His etiketine birleştirildi. Plazmid DNA, Cowin Biosciences GoldVac EndoFree plazmid maxi kiti kullanılarak gliserol stoklarından (Twist Biosciences) hazırlandı. Plazmidler, üreticinin tavsiyelerine göre 3 ml veya 50 ml Expi293F (Gibco) hücre kültürlerine transfekte edildi. Hücreler toplanmadan önce 4-5 gün 37 °C’de inkübe edildi. Protein ekspresyonunun ardından hücre kültürü süpernatantı, 0,22 uM’lik bir filtreden filtrelendi ve MabSelect protein A afinite kromatografi reçinesi (Cytiva) kullanılarak saflaştırıldı. Kolon PBS ile yıkandı ve protein, Tris glisin tamponu pH 2.5 içerisinde elüt edildi. Elüsyonun ardından proteinler, 10 kDa’lık moleküler ağırlıklı bir kesme diyaliz kaseti kullanılarak PBS’ye diyaliz edildi. Biyotinlenmiş PD-1 proteininin üretimi için PD-1 plazmidi, BirA plazmidi (2:1 oranı) ile birlikte transfekte edildi. BirA plazmidi BirA dizisini içerir (UniProtKB P06709) pcDNA3.4 vektöründe bir C-terminal Bayrak etiketi ile.

PD-1’in bağlanma karakterizasyonu

Tasarımlar başlangıçta biyotinlenmiş insan PD-1’e veya BLI (Sartorius OctetRED384) kullanılarak rastgele bir proteine ​​bağlanma açısından tarandı. Biyotinlenmiş insan PD-1 proteini ve biyotinlenmiş lizozim (GeneTex), %0,1 sığır serum albümini (BSA) (PBSA) içeren PBS içerisinde 500 nM’de hazırlandı. Tasarımlar PBSA’da 5 uM’ye seyreltildi. Streptavidin etiketli biyosensörler, biyotinlenmiş insan PD-1 veya biyotinlenmiş tavuk lizozimiyle doyuruldu. Tasarımların daha sonra 60 saniye boyunca hareketsizleştirilmiş ligandla birleşmesine izin verildi, ardından PBSA’da bir ayrışma adımı uygulandı. Temel çıkarılmış sinyal (nanometre) hesaplandı ve daha ileri karakterizasyon için insan PD-1’e özgü bağlayıcılara öncelik vermek için kullanıldı.

Seçilen tasarımların afinitesini belirlemek için, PBSA’da hazırlanan 100 nM biyotinlenmiş insan PD-1’i, 15 saniye boyunca streptavidin etiketli bir biyosensör üzerinde immobilize edildi. Tasarımların seri seyreltilerinin (2,5 uM’den 5 nM’ye kadar) daha sonra 180 saniye boyunca hareketsizleştirilmiş ligandla birleşmesine izin verildi, ardından 300 saniye boyunca PBSA’da bir ayrışma adımı uygulandı. Yalnızca tampon (PBSA) eğrisi kullanılarak BLI bağlanma eğrilerinin arka plan çıkarımının ardından, k_D Veri Analizi HT v.11.1 eğri uydurma modülündeki 1:1 modeli kullanılarak belirlenmiştir.

Tasarlanan proteinin PD-1’e bağlanma konusunda pembrolizumab ile rekabet edip etmediğini belirlemek için PBSA’da 100 nM biyotinlenmiş insan PD-1’i 15 saniye boyunca streptavidin kaplı biyosensörler üzerinde immobilize edildi. PBSA’da hazırlanan 200 nM pembrolizumab ile ilk ilişkilendirme 180 saniye boyunca gerçekleştirildi, ardından 180 saniye boyunca PBSA’da hazırlanan 200 nM tasarımla ikinci ilişkilendirme yapıldı.

SPR bağlama ve rekabet deneyleri

SPR ölçümleri, HBS-EP + tampon (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, %0,005 (h/h) Yüzey Aktif Madde P20 GE Healthcare) içindeki Biacore 8 K sistemi (Cytiva) kullanılarak gerçekleştirildi. Hedef proteinler, 10 mM NaOAc pH 4.5 içerisinde 10 ul dk-1 akış hızında 130-250 saniye boyunca amid birleştirme yoluyla bir CM5 çipi (GE Healthcare) üzerinde immobilize edildi.⁻¹ 100 göreceli yanıt birimi hedefleniyor. Tasarlanan bağlayıcılar veya kontrol proteinleri, bağlayıcı ön taraması sırasında tek bir 10 uM konsantrasyonda veya bağlanma kinetiğini değerlendirmek için seri seyreltmelerde analit olarak enjekte edildi. Bunlar 30 ul dk-1 akış hızında enjekte edildi⁻¹değişen bir temas süresi için, ardından ayrışma. Gerekirse çip yüzeyi, 30 ul dk-1 akış hızında 30 saniye boyunca 10 mM Glisin-HCl pH 2,5 kullanılarak her enjeksiyondan sonra yenilendi.⁻¹ . Bağlanma eğrileri, Biacore 8K analiz yazılımında 1:1 Langmuir bağlanma modeliyle donatıldı. Kararlı durum tepki birimleri analit konsantrasyonuna karşı çizildi ve Python v.3.9’daki deneysel verilere bir sigmoid fonksiyonu yerleştirildi. k_D.

Rekabet analizleri aşağıdaki gibi gerçekleştirildi. PD-L1 ve IFNAR2 için hedef reseptörler hareketsiz hale getirildi ve analit olarak bağlayıcılar ve rakipler enjekte edildi. Yalnızca rakiple (A,1 uM), yalnızca tasarımla (B,1 uM) veya ilk yarışmacıyla (1 uM, A) ve ardından tasarım + rakiple (her ikisi de 1 uM, A + B) iki ardışık enjeksiyon gerçekleştirildi. Bet v1 için, REGN5713 (Antikor formatı) SPR çipi üzerinde immobilize edildi ve REGN5714 (Fab formatı) veya Birch-binder2 enjekte edilmeden (her ikisi de 1 µM) (2) önce Bet v1 alerjeni (1 µM) ile yüklenen ilk enjeksiyonda (1).

Hücre yüzeyi özgüllüğü ölçümleri

Spesifiklik ölçümleri için PD-1-b4, His etiketli bir protein olarak eksprese edildi ve saflaştırıldı. PD-1-Fc, glikosilasyon bölgelerinde (N → D) ve serbest sistein kalıntılarında (C → S) mutasyonlarla üretildi. Diğer tüm proteinler daha önce tarif edildiği gibi saflaştırıldı.

BLI deneyleri, bir Gator BLI sistemi ve GatorOne yazılımı (Gator Bio, v.2.7.3.0728) kullanılarak gerçekleştirildi. Tahliller, 10 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA ve %0,005 (h/h) Yüzey Aktif Madde P20 (GE Healthcare) içeren bir çalışma tamponunda gerçekleştirildi.

Hareketsizleştirme için Fc etiketli hedef proteinler (PD-L1, PD-1 ve IFNAR2) 5 µg ml-1’ye seyreltildi⁻¹ ve protein A biyosensör uçlarına (Gator Bio) yakalanır. Hareketsizleştirmenin ardından biyosensör uçları, saflaştırılmış bağlayıcının 1 uM solüsyonuna batırıldı.

Protein kristalizasyonu ve yapı tespiti

BBF-14-bağlayıcı4 kompleksi, 5 mg ml- konsantrasyonunda kristalleştirildi⁻¹ 0,1 M MES pH 6,0, 0,2 M sodyum asetat trihidrat, %20 a/h polietilen glikol (PEG) 8000 tamponunda (SG1-Eco Screen, Molecular Dimensions) 16 °C’de oturan damla buhar difüzyonu kullanılarak. P21 kristal formundaki Der f7-bağlayıcı2 kompleksi, 15 mg ml- konsantrasyonunda kristalleştirildi.⁻¹ 16 °C’de 0,1 M MES pH 6,5, 0,2 M KSCN, %25 a/h PEG 2000 MME tamponunda (Clear Strateji Ekranı I, Moleküler Boyutlar) oturan damla buhar difüzyonu kullanılarak. C121 kristal formundaki Der f7-bağlayıcı2 kompleksi, 15 mg ml- konsantrasyonunda kristalleştirildi.⁻¹ 16 °C’de 0,1 M MES pH 6,5 ve %20 v/v PEG smear yüksek BCS’de (BCS Ekranı, Moleküler Boyutlar) oturan damla buhar difüzyonu kullanılarak. Der f21 – bağlayıcı10 kompleksi, 30 mg ml- konsantrasyonunda kristalleştirildi⁻¹ 16 °C’de 0,1 M sodyum sitrat pH 5,6, 1,0 M LiSO içinde oturan damla buhar difüzyonu kullanılarak₄0,5 M NH₄BU YÜZDEN₄ tampon (SG1-Eco Ekran, Moleküler Boyutlar). Kristaller %25 gliserol içerisinde kriyokorumaya tabi tutuldu ve sıvı nitrojen içerisinde flaşla soğutuldu. Kırınım verileri, Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi MASSIF-3 ve ID30B ışın hatlarında, Grenoble, Fransa’da 100 K sıcaklıkta toplandı. Kristalografik veriler, autoPROC paketi kullanılarak işlendi.⁵⁷. Fazlar, Phaser kullanılarak moleküler değiştirme yoluyla elde edildi⁵⁸. COOT kullanılarak atom modeli iyileştirmesi tamamlandı⁵⁹ ve Phenix.refine⁵⁸. Geliştirilmiş modellerin kalitesi MolProbity kullanılarak değerlendirildi⁶⁰. Yapısal rakamlar ChimeraX kullanılarak oluşturuldu⁶¹.

Cryo-EM yapı tespiti

SpCas9, üç kat fazla bağlayıcı3 veya bağlayıcı10 ile karıştırıldı ve kompleks, 20 mM Tris-HC pH 7.5, 250 mM KCl içerisinde S200 10/300 jel filtrasyon kolonu (GE Healthcare) kullanılarak saflaştırıldı. Saflaştırılmış kompleks, parıltılı boşaltılmış 300 gözenekli delikli karbon ızgaraya 300 gözenekli delikli karbon ızgarasına (Au 1.2/1.3 QuantifoilMicro Tools) uygulandı, %95 nemde, 10 °C’de 4 saniye süreyle kurutuldu, sıvı etan (Vitrobot Mark IV, FEI) içinde daldırılarak dondurulmuş ve sıvı nitrojen içinde saklandı. Veri toplama, FEI Falcon IV dedektörü ve SelectrisX enerji filtresiyle donatılmış 300 kV Titan Krios G4 mikroskobu üzerinde gerçekleştirildi. Mikrograflar, ×165.000 büyütmede, 0,726 Å piksel boyutunda ve -0,8 mm ile -2,2 mm arasında değişen nominal odaksızlıkta kaydedildi.

Elde edilen cryo-EM verileri, cryoSPARC v.4.6.0 (ref. ⁶²). Mikrograflar yama hareketi düzeltildi ve çözünürlük tahmini 5 Â’dan kötü olan mikrograflar yama kontrast transfer fonksiyonu tahmininden sonra atıldı. İlk parçacıklar 90-135 Å’de damla toplayıcı kullanılarak toplandı. Parçacıklar, 360 x 360 piksellik bir kutu boyutunda çıkarıldı ve 220 x 220 piksele alt örneklendi. İki boyutlu sınıflandırmanın ardından, başlangıçtan itibaren üç boyutlu (3D) yeniden yapılandırma ve başlangıçta tekdüze olmayan 3B yeniden yapılandırma için temiz parçacıklar kullanıldı.⁶³. Bu model, parçacıkların ekstra şablon bazlı toplanması için kullanıldı. Bağlanmamış Cas9 içeren sınıfların hariç tutulduğu birkaç 3 boyutlu sınıflandırma turunun ardından, en ayrıntılı bağlayıcı özelliklere sahip sınıf, tam kutu boyutu kullanılarak yeniden çıkarıldı ve son yeniden yapılandırmaları oluşturmak için tekdüze olmayan ve yerel iyileştirmelere tabi tutuldu. Yerel çözünürlük ChimeraX kullanılarak hesaplandı ve görselleştirildi⁶¹. In silico modelleri ChimeraX kullanılarak yoğunluğa yerleştirildi⁶¹.

Huş ağacı alerjen engelleme deneyi

Anti-Bet v1 bağlayıcı engelleme kapasitesi, ilk olarak NuncSorp (Thermo Fisher) plakalarının 2 μg ml ile kaplanmasıyla değerlendirildi.⁻¹ kaplama tamponu (15 mM Na) içindeki anti-insan IgE monoklonal antikorunun (NBS-C BioScience; klon Le27; 0908-1-010)₂CO₃34,87 mM NaHCO₃) ve gece boyunca 4 °C’de inkübe edildi. Plakalar PBS + %0,05 Tween ile yıkandı ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca PBS + %1 BSA kullanılarak bloke edildi. Daha sonra huş ağacına alerjisi olan hastalardan alınan serumlar 4 ng ml konsantrasyonunda eklendi.⁻¹anti-Bet v1 IgE. 1 nM konsantrasyonunda biyotinlenmiş Bet v1 alerjeni, 2 μM’den başlayan Bet v1-binder2’nin dört kat seri seyreltileriyle veya REGN5713, REGN5714 ve REGN5715 kokteylinin (her biri 50 nM’den başlayarak) beş kat seri seyreltileriyle oda sıcaklığında 2 saat boyunca önceden inkübe edildi ve daha sonra IgE kaplı plakaya eklendi. Oda sıcaklığında 2 saatlik inkübasyonun ardından plakalar, PBS + %0,05 Tween ile yıkandı ve streptavidin yaban turpu peroksidaz (BD Pharmigen; 554066; 1:1,000 seyreltme) ilave edildi ve 1 saat süreyle inkübe edildi. Plakalar yıkandı ve tetrametilbenzidin substratı (BD Biosciences; 555214) ilave edildi ve 20 dakika daha inkübe edildi. Reaksiyon 2 M sülfürik asit ile durduruldu. Absorbans, 630 nm referansla 450 nm’de bir spektrofotometre üzerinde ölçüldü ve blokaj yüzdesi, bağlayıcının yokluğunda numunenin absorbansının çıkarılmasıyla ölçüldü.

MST

CLDN1 WT, 1:5 molar fazla boya eklenerek ve 2 saat buz üzerinde inkübe edilerek Cy5 ile etiketlendi. Fazla boya, bir PD-10 kolonundan geçirilerek uzaklaştırıldı. Etiketli protein toplandı ve sıvı nitrojende hızlı dondurmanın ardından -80 °C’de küçük parçalar halinde saklandı.

MST tabanlı etkileşim çalışmaları için Monolith (Nanotemper) cihazı kullanıldı. Ligandın (CLDN1 – b12 / CpE – Nd33) seri seyreltmeleri, tampon B’de (25 mM HEPES pH 8,0, 200 mM NaCl, %5 gliserol %0,03 DDM) yapıldı ve 10 nM etiketli CLDN1 WT ile karıştırıldı. 10 dakikalık inkübasyonun ardından numuneler kılcal damarlara (Monolith standart kılcal) aktarıldı ve okumalar başlatıldı. Spektral kayma verileri çizildi ve bir k_D model ve tahmini k_Delde edildi. Veriler kullanılarak yerleştirilemediğinde k_D Modelde verilere uyum sağlamak için Hill modeli kullanıldı. CpE-Nd33 ve CLDN1-b12’nin hedef CLDN1 WT’ye rekabetçi bağlanmasını incelemek için ikinci bir deney seti gerçekleştirildi. CLDN1 WT, CLDN1 – b12 (2 x) ile inkübe edildi k_D) ve ardından CpE-Nd33 ile mücadele edildi.

Sitotoksisite deneyi

Claudin bağlayıcıların, claudinleri eksprese eden Sf9 hücrelerinde gözenek oluşumunu inhibe edip edemediğini araştırmak için, 24 oyuklu bir plakadaki yapışık Sf9 hücreleri, CLDN1 veya CLDN4 içeren bakulovirüs ile enfekte edildi. Tahlil daha önce gösterildiği gibi gerçekleştirildi²⁰. Kısaca her claudin için 12 kuyucuklu bir deney yapıldı. Bağlayıcıların CpE-Nd33’ün gözenek oluşturma kapasitesi üzerindeki etkisini test etmek için altı kuyu kullanıldı ve diğer altı kuyu kontrol olarak kullanıldı. 36 saatlik enfeksiyondan sonra, her bir bağlayıcıdan 4 uM altı farklı kuyucuğa ilave edildi ve plaka daha sonra yavaşça döndürülerek karıştırıldı ve 5 dakika boyunca inkübe edildi. Bundan sonra altı kuyucuğun her birine 300 nM CpE-Nd33 eklendi. Aşağıdaki kontroller deney 1’de kullanıldı. Bakülovirüs enfeksiyonu olmayan Sf9, 2. Claudin ile enfekte olmuş ancak CpE-Nd33 ile tedavi edilmemiş Sf9, 3. Claudin ile enfekte olmuş ve CpE-Nd33 ile tedavi edilmiş Sf9 4. Claudin ile enfekte edilmiş ve COP4 Fab ile tedavi edilmiş (CpE inhibitörü olarak anılır) Sf9 5. Claudin ile enfekte edilmiş ve COP4 ile tedavi edilmiş Sf9 ve ardından aşağıdaki kontroller eklenmiştir. 5 dakika inkübasyondan sonra CpE-Nd33. Ölü veya canlı hücre sayısı, 18 saatlik inkübasyondan sonra hücrelerin tripan mavisi ile boyanması ve otomatik bir hücre sayacı (Invitrogen Countess) kullanılarak hücre sayısının ölçülmesi yoluyla ölçüldü.

SpCas9 gen düzenlemesi

SpCas9-tek kılavuzlu RNA (sgRNA) plazmid klonlaması için lentiCRISPR v2 (Addgene no. 52961, F. Zhang’dan bir hediye) BsmBI (NEB) ile sindirildi. NSD2 genini hedef alan sgRNA’yı kodlayan oligonükleotidler tavlandı ve sindirilmiş lentiCRISPR v2 plazmitine bağlandı. Tüm bağlayıcılar, GenSmart Kodon Optimizasyon aracı kullanılarak insan kodon optimizasyonuna tabi tutuldu ve Twist bioscience’dan klonlama için homoloji çıkıntılarına sahip ekler olarak sipariş edildi. Nihai bağlayıcı plazmitler, izotermal birleştirme (NEBuilder HiFi DNA Montaj Klonlama Kiti, NEB) ile üretildi.

HEK293T (ATCC CRL-3216) hücreleri, 37 °C’de %10 (hacim/hacim) fetal sığır serumu (Sigma-Aldrich) ve 1 x penisilin-streptomisin (Thermo Fisher Scientific) ile desteklenmiş DMEM artı GlutaMax’ta (Thermo Fisher Scientific) muhafaza edildi ve %5 CO2₂. Hücreler %90’ın altında birleşim noktasında tutuldu ve her 2-3 günde bir pasajlandı. İnhibitör verimliliğini test etmek için HEK293T hücreleri, 48 oyuklu hücre kültürü plakalarına (Greiner) ekildi ve üreticinin talimatlarına göre (Thermo Fisher Scientific) 300 ng Cas9 + sgRNA plazmidi, 500 ng inhibitör plazmidi ve 5 ul Lipofectamine 2000 kullanılarak %70 birleşme noktasında transfekte edildi. Ertesi gün hücreler bölündü ve Puromisin, Blastisidin veya her ikisi ile seçildi. Transfeksiyondan üç gün sonra hücreler toplandı ve genomik DNA, doğrudan lizis yoluyla izole edildi.

Hücre lizatından elde edilen DNA, daha önce açıklandığı gibi yeni nesil dizileme için hazırlandı.⁶⁴. İlk PCR turunda ilgi konusu genomik bölgeler, GoTaq Green Master Mix (Promega) ve Illumina ileri ve ters adaptör dizilerini içeren primerler kullanılarak amplifiye edildi. Yine GoTaq Green Master Mix’in (Promega) kullanıldığı ikinci PCR turunda, ilk turdaki ürünlere p5–p7 barkodları eklendi. Ortaya çıkan amplikonlar havuzlandı ve bir Qubit 3.0 florometre (Invitrogen) kullanılarak ölçüldü. Kütüphaneler daha sonra bir MiSeq platformu (Illumina, 150 bp, eşleştirilmiş uç) kullanılarak dizildi. Sıralama verileri ve sonuçta ortaya çıkan gen düzenleme ekleme-silme oranları, CRISPResso2 (ref. ⁶⁵).

CbAgo in vitro bölünme deneyi

İn vitro bölünme analizleri için bağlayıcılar, CbAgo, 5′-fosforile edilmiş 16-nt tek sarmallı DNA (ssDNA) kılavuzu (oDS423) ve Cy5 etiketli 45-nt ssDNA hedefi (oDS401), 10 mM HEPES pH 7,5, 125’te 2:0,4:0,4:0,2 μM’lik nihai konsantrasyonlara kadar karıştırıldı mM KCl ve 2 mM MgCl₂. Bu amaçla öncelikle bağlayıcı protein ve CbAgo karıştırılarak 37 °C’de 15 dakika inkübe edildi, ardından karışım buz üzerinde inkübe edildi ve kılavuz ssDNA ve hedef ssDNA eklendi. Daha sonra reaksiyon karışımları 37 °C’de inkübe edildi ve örnekler 0 dakikalık, 4 dakikalık, 10 dakikalık, 30 dakikalık ve 60 dakikalık zaman noktalarında alındı. Her zaman noktasında alınan numuneler, 2x RNA yükleme boyası (25 mM EDTA, %5 v/v gliserol, %90 v/v formamid) eklenerek ve 95 °C’de 5 dakika ısıtılarak doğrudan söndürüldü. Bölünme ürünleri, denatüre edici (7 M üre) %20 poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak çözüldü ve jeller, bir Amersham Typhoon jel tarayıcı (Cytiva Life Sciences) kullanılarak görüntülendi. Her bir bağlayıcı protein için bölünme reaksiyonları üç kopya halinde gerçekleştirildi. CbAgo hedef bölünmesi, ImageQuant TL 1D v.8.2.0 (Cytiva Life Sciences) kullanılarak ölçüldü ve başlangıç ​​(hızlı) ve dönüşüm (yavaş) bölünmeyi modellemek için çift üstel bir bozunma modeline doğrusal olmayan en küçük kareler uyumu (R paketi minpack.lm’den nlsLM) ile donatıldı:

Çift üstel bozunma modeline uyma, artıklarla ve 1 × 10 gradyan yakınsama toleransıyla 1.024 yinelemeden sonra uyum sağlamadıysa⁻⁹ciro bölünmesi (yavaş) ihmal edilebilir olarak kabul edildi ve tek üstel bir bozulma modeli (yani, B= 0) kullanıldı.

Tüm numuneler içink_kedi başlangıç ​​hızı için uyum sabitlerinden hesaplandı (A vek₁):

Ortalama ve standart sapmak_kedi üç deney kopyası kullanılarak hesaplandı.

CbAgo BLI bağlanma kinetiği

BLI ölçümleri Gator BLI sistemi ve GatorOne yazılımı (Gator Bio, v.2.7.3.0728) kullanılarak yapıldı. Çalıştırma tamponu 150 mM KCl, 20 mM HEPES (pH 7,5) ve %0,5 BSA’dan oluşuyordu. His etiketli CbAgo bağlayıcıları, sensör uçlarında 10 µg ml- konsantrasyonunda immobilize edildi⁻¹ . Hareketsizleştirmenin ardından uçlar, CbAgo’nun seri seyreltilerine aktarıldı. Bağlanma eğrileri, Gator yazılımındaki 1:1 etkileşim modeli kullanılarak küresel olarak yerleştirildi.

CbAgo SEC bağlama doğrulaması

Saflaştırılmış CbAgo, 0,8 mg ml-‘ye seyreltildi⁻¹ (9,3 µM) ve 0,2 mg ml ile karıştırıldı⁻¹bağlayıcı protein ve SEC tamponunda (20 mM HEPES pH 7,5, 250 mM KCl ve 2 mM MgCl) 9,3 μM 5′-fosforile edilmiş 16-nt ssDNA kılavuzu (oDS423)₂). Karışım oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edildi. İnkübasyondan sonra numuneler, 0,75 ml dk-1 akış hızına sahip SEC tamponu kullanılarak 1260 Infinity II yüksek performanslı sıvı kromatografi sistemine (Agilent) bağlı bir Superdex 200 Artış 10/300 GL kolonunda (Cytiva Life Sciences) oda sıcaklığında çözüldü.⁻¹ . Elüsyon, 280 nm’de bir Agilent 1260 Infinity II Çoklu Dalga Boyu Detektörü kullanılarak ölçüldü. Veriler Astra v.8.1 (Wyatt Technology) kullanılarak analiz edildi.

AAV mühendisliği

Yörüngesel olarak çalkalanan biyoreaktörlerde (HEKExpress, ExcellGene SA) kültüre uyarlanan HEK293 hücreleri, serumsuz BalanCD HEK293 Ortamında (Irvine Scientific) muhafaza edildi ve aşağıdakilerle desteklendi: ben-alanil-ben-glutamin (Gibco GlutaMax), 37 °C’de, %80 nem, %5 CO₂180 rpm’de sürekli çalkalama altında (çalkalama çapı 5 cm). Hücreler her 3-4 günde bir 0,2 x 106 konsantrasyona kadar pasajlandı.⁶ml başına hücre. AAV transdüksiyon deneylerinde kullanılan hedef reseptörleri stabil bir şekilde eksprese eden hücre çizgilerinin oluşturulması için, reseptör tamamlayıcı DNA’lar (cDNA’lar), bir açık okuma çerçevesi koleksiyonundan (HER2, ORFeome Collaboration cDNA Clone, PD-L1, Addgene no. 121142) elde edildi ve insanın kontrolü altında ekspresyonla bir pRRLSIN lentiviral mekik yapısına (Addgene no. 12252) klonlandı. fosfogliserat kinaz (hPGK) promoteri. Lentiviral parçacıklar, HEK293T hücrelerinin pRRLSIN-hPGK-WPRE, p8.92, pMD2G ve pAdVAntage plazmitleri ile kalsiyum fosfat transfeksiyonuna yönelik standart prosedürler kullanılarak üretildi. 48 saatte vektör içeren süpernatan toplandı, filtrelendi ve ultrasantrifüjleme yoluyla konsantre edildi. Elde edilen vektör süspansiyonunda mevcut olan lentiviral parçacıkların sayısı, bir p24 antijen ELISA kiti (ZeptoMetrix) kullanılarak ölçüldü. HEKExpress hücreleri, 3.0 x 106 yoğunlukta altı oyuklu bir plakaya dönüştürüldü⁶ Hücre başına 100 vg’lik bir enfeksiyon çokluğu (MOI) kullanılarak oyuk başına hücre (dönüşüm faktörü 1 pg p24 = 1 x 10⁴ vg). 5 gün sonra hücreler, bir APC-konjuge antikor (0.8 µg ml-1) kullanılarak ilgili hedef reseptörün varlığı açısından boyandı.⁻¹ BioLegend, 329707 (PD-L1), 324407 (HER2)) boyama tamponunda (%0,5 BSA içeren PBS (Merck)) ve bir Sony SH800 hücre sıralayıcı kullanılarak akış sitometrisine göre sıralandı. Genişlemenin ardından hücreler bölündü ve bir sonraki kullanıma kadar -80 °C’de donduruldu.

Rep (AAV2) ve cap (değişken) genlerini kodlayan HEKExpress hücrelerinin geçici transfeksiyonu yoluyla AAV üretimi için pRepCap plazmitleri, belirtildiği gibi farklı varyantlara göre seçildi. Serotip 6 vahşi tip AAV için üreticiden bir AAV6 plazmidi sipariş edildi (Aldevron, pALD-AAV6). Heparin (K459S ve K531E) ve sialik asit (V473D, N500E ve T502S) ile birincil etkileşimleri tüketmek amacıyla nakavt mutasyonlarını taşıyan varyant için, karşılık gelen bir gen fragmanı homoloji çıkıntılarına sahip bir ek olarak sipariş edildi (Twist Biosciences) ve pRepCap nakavtını sağlayan BspEI/MscI tarafından pALD-AAV6’ya klonlandı. Tasarlanan miniprotein bağlayıcıları kodlayan diziyi tanıtmak için, birincil etkileşimleri tüketen beş mutasyona ek olarak, serotip 6 VP3’ün 497 ve 498. amino asit pozisyonları arasında seçilen bağlayıcı yerleştirme bölgesinin yakınında MluI/Nhel kısıtlama bölgeleri sağlayan iki sessiz mutasyon taşıyan bir ara plazmit yaratıldı. Tasarlanan miniprotein bağlayıcılar için DNA dizileri, tek bir –(GSG) ile çevrelenmiştir.₁– her iki terminaldeki bağlayıcı, GenSmart Kodon Optimizasyon aracı kullanılarak insan kodonu optimize edildi ve alt klonlama için homoloji çıkıntılarına (Twist Biosciences) sahip ekler olarak sipariş edildi.

Küçük ölçekte taramaya yönelik AAV üretimi için hücreler, 0,4 x 106 yoğunlukta 24 oyuklu hücre kültürü plakalarına ekildi.⁶500 ul hacimde ml başına hücre ve 520 ng pHelper (Aldevron, pALD-HELP), 250 ng mekik plazmidi (Aldevron, pALD-ITR-GFP), 270 ng pRepCap (değişken) ve 1.5 ug polietilenimin (Polysciences) ile transfekte edildi. Uygun olduğu takdirde, varyantların pRepCap plazmitleri sırasıyla 1:2 oranında pRepCap nakavt plazmidi ile karıştırılmıştır. Daha sonra transfeksiyondan 12 saat sonra hücrelerin ortamı değiştirildi ve 4 mM valproik asit (Sigma) ile desteklendi. Hücre kültürü yukarıda açıklanan standart koşullarda ancak çalkalamadan inkübe edildi ve AAV içeren ortam, 400°C’de santrifüjleme kullanılarak süpernatan toplanarak 5. günde hasat edildi.GHücreleri çıkarmak için oda sıcaklığında 5 dakika.

Normalleştirilmiş bir MOI’de doğrulama amaçlı AAV üretimi için hücreler 1,0 x 106 yoğunlukta ekilmiştir.⁶Bir TubeSpin 600 biyoreaktör tüpünde (TPP) 300 ml’lik bir hacimde ml başına hücre sayısı ve 231 µg pHelper (Aldevron, pALD-HELP), 105 µg mekik plazmidi (Aldevron, pALD-ITR-GFP), 105 ng pRepCap (değişken) ve 900 µg polietilenimin (Polysciences) ile transfekte edildi. Uygun olduğu takdirde, pRepCap plazmitleri yukarıda anlatıldığı gibi elde edildi ve pRepCap nakavt plazmidi ile 1:2 oranında karıştırıldı. Daha sonra transfeksiyondan 6 saat sonra hücre kültürü ortamına 4 mM valproik asit (Sigma) eklendi. Hücre kültürü yukarıda açıklanan standart koşullarda 7 gün boyunca inkübe edildi ve vektör, biyoreaktör tüpünün 800°C’de santrifüjlenmesinden sonra süpernatan toplanarak 3-4. günde ve 7. günde hasat edildi.G10 dakika oda sıcaklığında. Süpernatan filtrelendi (Stericup Quick Release, Millipore Express PLUS 0.22 μm PES, 1.000 ml, Merck Millipore). Parçacıklar, hücre kültürü süpernatanından en az 3,0 x 106 konsantrasyona kadar konsantre edildi¹⁰vg ml⁻¹100 kDa’lık (Merck) moleküler ağırlık kesiminde Amicon Ultra-15 santrifüj filtre üniteleri kullanılarak. Yabani tip ve nakavt varyant parçacıkları, Gaudry ve arkadaşlarına göre alternatif olarak işlendi.⁶⁶. Kısacası, parçacıklar, bir ÄKTA Pure kromatografi sistemi üzerinde POROS CaptureSelect AAVX reçinesi (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak hücre kültürü süpernatanından saflaştırıldı ve ardından Amicon Ultra-15 santrifüj filtre üniteleri aracılığıyla PBS, %0,001 Pluronic F-68 (%10 stok çözeltisi, Gibco) ile 100 kDa’lık (Merck) moleküler ağırlık kesiminde tampon değişimi yapıldı. Genom içeren AAV parçacıklarının sayısı, QIAcuity sistemi ve PCR kiti (Qiagen) kullanılarak dijital PCR ile DNaz I (Thermo Fisher) ile muameleden sonra belirlendi.

Transdüksiyon için hedef hücreler, 3 x 106 yoğunlukta 96 oyuklu hücre kültürü plakalarına ekildi.⁵100 ul’lik bir hacimde ml başına hücre. 6 saat sonra hücrelerin ortamı, 24 oyuklu hücre kültürü plakalarındaki üretimden elde edilen 100 ul AAV içeren ortamla veya 3 x 106’ya 100 ul seyreltmeyle değiştirildi.¹⁰vg ml⁻¹1 × 10 MOI elde etmek için 300 ml kültürde üretimden elde edilen malzemenin⁵hücre başına vg. Varsa, 0,8 µg ml⁻¹hedef reseptör bloke edici antikor (BioLegend, 329707) eklenmiştir. 48 saat sonra hücreler, %0,5 BSA (Merck) içeren 100 ul PBS ile iki kez yıkandı ve transdüksiyon sinyali (GFP), otomatik bir plaka okuyucuyla donatılmış bir Attune NxT analiz cihazında (Thermo Fisher) akış sitometrisi ile ölçüldü. Sonuçlar FlowJo v.10.8 Yazılımı (BD Life Sciences) kullanılarak analiz edildi.

Raporlama özeti

Araştırma tasarımına ilişkin daha fazla bilgi şu adreste mevcuttur:Doğa Portföyü Raporlama Özeti bu makaleye bağlı.