İki farklı konakçı özel mantar türü yarasalarda beyaz burun hastalığına neden olur

Örnek ve saha veri toplama

Swab örnekleri P. yıkım Bat Hibernacula’dan toplandı. Hazırda bekletici yarasalardan örnekleme, yarasalar serbestçe asılı kalırken, örnek toplayarak yakalama veya kullanım olmadan gerçekleştirildi. Numuneler, enfekte olmuş alanların steril kuru bir sürüntü (polyester Swab 164KS01, Copan) ile hafifçe sürüklenerek toplandı. Bu yöntem minimal invaziv veya hatta noninvaziv olarak kabul edilir^45–46. Örnek toplama zamanlaması genellikle görünür enfeksiyonu olan en fazla sayıda yarasa bildirildiğinde Ocak ve Nisan ayları arasında yapıldı.¹⁵. Hiçbir yarasa mevcut olmadığında veya örneklemenin mümkün olmadığı zaman, Swab’ı Hibernacula duvarlarına dokunarak duvar çubukları toplanmıştır (ideal olarak yarasaların genellikle kış uykusuna bağlı kaldığı yere yakın; bkz. Ref. ³⁴ daha fazla ayrıntı için). Hibernacula’nın içinden toplanan tortu örneklerinden dört izolat da elde edildi ve 22’si, büyük olasılıkla Hibernacula ortamlarıyla temastan kaynaklanan mağaralama dişlilerinden (yani mağaralama kıyafetleri ve koşum takımlarından) toplandı.⁴⁴.

Bir numune bir yarasa veya yakın (yaklaşık 10 cm içinde) alındığında, yarasa türleri de kaydedildi. Hibernakulada sıcaklık ve bağıl nem ölçüldü. Daha sonra mutlak nem, daha önce tarif edilen bir formül uygulanarak nispi nem ve sıcaklık ölçümlerinden hesaplandı⁴⁷.

Çalışmamız, araştırma ve eğitimde vahşi memelilerin kullanımı için Amerikan Memmalogcular Derneği’nin etik vahşi yaşam araştırma yönergelerine bağlı kaldı⁴⁸. Ayrıca, bu çalışma aşağıdaki yetkililerin izni altında yürütülmüştür: İtalya, Emilia-Romagna Bölgesel Speleoloji Federasyonu (FSRER) ve Emilia-Romagna parklarının yönetim organları; Polonya, Genarny Dyorector Ochrony środowiska (Çevre Koruma Genel Müdürü) ve Gorzów Wielkopolski’de Çevre Koruma Bölge Müdürlüğü (Bölge Dyrekcja Ochrony środowiska W Gorzowie Wielkopolskim); İsviçre, kanton yarasa koruması aargau; Germany, environmental office, veterinary office, lower landscape authority in Siegen-Wittgenstein, Untere Nature Conservation Authority Environmental Office Harz and Unit Consumer Protection, Veterinary Affairs State Administration Office Saxony-Anhalt, Lower Nature Conservation Authority of the district of Vorpommern-Greifswald, government of Lower Franconia, Government of Middle Franconia, Structural and Approval Directorate North/South, NLWKN Lower Saxony State Operation su wirtschaft, kıyı ve doğa koruma ve bölge Hannover-saha ortamı için; Avusturya, Carinthia, Aşağı Avusturya, Yukarı Avusturya, Salzburg, Styria ve Vorarlberg için Doğa Koruma Bölümü; Macaristan, Pest Megye Kormányhivatal, Országos Könezetvédelmi, Természetvédelmi és HulladékgazdálkioDási főostály (Pest County Hükümeti Ofisi, Çevre Koruma, Doğa Koruma, Doğa Koruma ve Yönetim Bakanlığı); Bulgaristan, Bulgar Çevre ve Su Bakanlığı; Fransa, DDTM-Morbihan ve Dreal; Letonya Cumhuriyeti, Doğa Koruma Ajansı; Belçika, Hükümet Walon; Danimarka, Doğa Ajansı ve Daugbjerg Kalkgruber; Romanya, Speleolojik Miras Komisyonu; Estonya, Estonya Çevre Kurulu; İngiltere, Doğal İngiltere; Finlandiya, Güneybatı Finlandiya Ekonomik Kalkınma, Ulaştırma ve Çevre Merkezi; İsveç, Uppsala Djurförsöketiska Nämnd, İsveç Tarım Kurulu ve İsveç Çevre Koruma Ajansı; Norveç, Miljød Müdürlüğü; Lüksemburg, ministère du développement dayanıklı et des altyapıları du lüksemburg; Hırvatistan, Hırvat Çevre ve Doğa Bakanlığı; Rusya Federasyonu, Karelya Cumhuriyeti Oyun Yönetimi Müdürlüğü, Bitki ve Hayvan Ekolojisi Enstitüsü ve Rusya Bilimler Akademisi Ural Bölümü; Slovak Cumhuriyeti, Slovak Cumhuriyeti Çevresi Bakanlığı ve Doğa ve Peyzaj Koruması Devlet İdaresi Bölümü; Hollanda, Hollanda Ekonomik İşler Bakanlığı; Moldova Cumhuriyeti, Moldova Cumhuriyeti Hükümeti – Çevre Bakanlığı.

Laboratuvar malzemeleri ve yöntemleri

Kültürler ve genotipleme

Daha önce yayınlanmış DNA ekstraksiyonu ve genotipleme protokolleri kullanıldı^20–34ve burada kısaca özetlenir. P. yıkım kış uykusuna yatan yarasalardan ve yarasaların kış uykusuna yattığı alanların duvarlarından steril çubuklar kullanılarak toplandı. Toplanan mantar malzemesi dekstroz pepton maya agar üzerinde kültürlendi⁴⁹ klasik mikolojik prosedürleri kullanma ve her kullanım arasında araçların sterilizasyonu. Çimlenmeyi gözlemledikten sonra, tabaklamadan 3-5 gün sonra, plakalar çimlenmiş tek sporları tanımlamak için bir mikroskop ile tarandı (tek bir çimlenme sporundan genişleyen koloniler olarak tanımlandı). Kullanılabilirliğe bağlı olarak, 1-3 (ortalama = 3.0, medyan = 3) ve 1-5 (ortalama = 3.6, medyan = 2) tek sporlar tipik olarak yarasa ve duvar çubuklarından izole edildi. İzolasyon, steril 3 mm biyopsi yumruk ile bir fişin eklenmesi ve onu 6 cm’lik yeni bir petri kabına aktararak gerçekleştirildi. Daha sonra plakalar, fişte hiçbir ek sporun çimlenmediğini doğrulamak için 1 hafta boyunca görsel olarak izlendi. Plakalar, DNA’yı çıkarmak için yeterli malzeme olana kadar 10−15 ° C’de büyütüldü (genellikle birkaç hafta ila ay sonra). Bu kolonilerin her biri daha sonra bir izolat veya kültür olarak adlandırılır. DNA ekstraksiyonu, bir Magmax Bitki DNA İzolasyon Kiti (Thermo Scientific) ile bir Kingfisher Flex Ekstraksiyon Robotu (Thermo Scientific) kullanılarak yapıldı. DNA ekstraksiyonundan sonra izolatlar, dört multipleksde 18 mikrosatellit markeri ve iki çiftleşme tipi belirteç kullanılarak genotiplendi. İki çiftleşme tipi belirteç, iki çiftleşme tipinin (MAT1-1 ve MAT1-2) segmentlerini yükseltmek için kullanılan ve bu nedenle fragman-uzunluk analizi ile teşhis edilebilir iki bağımsız astar kümesi idi.²⁰. Genotipleme bir ABI 3130 genetik analizörü (Applied Biosystems) üzerinde gerçekleştirildi ve fragman analizi için genemapper yazılımı (v.5; Applied Biosystems) kullanıldı.

Minion ve Illumina için DNA ekstraksiyonu

Malzeme toplandı P. yıkım Sterilize cımbız kullanan kültürler. Bir sorbitol yıkama tamponu (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.35 m sorbitol, 5 mM EDTA pH 8.0 ve% 1 (w/h) polivinilpirrolidon (PVP-40)), mantar ortamının çoğunu hiphalardan 5 dakikalık inlukla tekrarladı) (yıkama, her bir zaman oda sıcaklığında iki kez tekrarlandı) kullandık. After removing the sorbitol wash buffer the second time (through centrifugation and removal of the liquid supernatant), 500 μl CTAB lysis buffer (preheated to 65 °C; 0.01 M Tris HCl pH 7.5, 25 mM EDTA pH 8.0, 1.5 M NaCl and 2% CTAB powder (w/v)), 30 μl proteinase K and 5 μl 1 M DTT were added Sindirim için ve gece boyunca 56 ° C’de inkübe edildi, ilk saatten sonra malzeme karıştırma. Numunelerin oda sıcaklığında 5 dakika soğumasına izin verildikten sonra, 4 uL RNaz A ilave edildi ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe etmek için bırakıldı. Bir hacim kloroform – izoamil alkol (24: 1 h/h) ilave edildi, daha sonra tüpler 30 kez ters çevrildi ve süpernatanı koruyarak maksimum hızda 5 dakika santrifüjlendi. Daha sonra, RNA varlığını azalttığı ve daha kaliteli DNA ile sonuçlandığı bulunduğu için, 56 ° C’de 30 dakika boyunca bir inkübasyon ile ikinci bir proteinaz K (30 uL) ve RNaz A (4 uL) tedavisinin ikinci aşaması ekledik. Bu enzimleri uzaklaştırmak için, 1 hacim ilave ederek, 30 kez tersine dönen ve 5 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj yaparak ikinci bir kloroform -izoamil alkol (24: 1 v/h) ekstraksiyon aşaması gerçekleştirdik, daha sonra süpernatan tutuldu. 1/10 hacim sodyum asetat, 2 hacim etanol (>% 99 saflık) ve maksimum hızda 20 dakika santrifüj kullanılarak DNA çökelmesi elde edildi. Sodyum asetat -etanol karışımının nazikçe çıkarılmasından sonra, sonuçta ortaya çıkan pelet (DNA içeren) iki kez% 70 etanol ile yıkandı. DNA daha sonra DDH içinde elüte edildi₂O ve buzdolabında saklanır. DNA içeriği Quit (ThermoFisher) kullanılarak belirlendi.

Minion nanopore sekanslaması için numune hazırlama

12 izolatın uzun süredir okunan Oxford Nanopore teknolojisi (ONT) sekanslaması (klon başına 5 Avrasya, 1 Kuzey Amerika ve 1 dış grup; Ek Tablo 10) Minion Flowcells (FLO-MIN-106), üreticinin talimatlarını izleyerek bir ONT ligasyon sekanslama kiti SQK-LSK109 ile hazırlanan kütüphaneleri kullanarak kullanın. Uzun süredir okunan sekanslama ve ilişkili birleştirilmiş genomların istatistikleri ek tablolarda sunulmaktadır 8 Ve 9.

Illumina sekanslama için örnek hazırlama (bireysel izolatlar)

Illumina sekanslaması, Illumina dizilerinin zaten mevcut olduğu GD1111 hariç minion uzun süredir okunan sekanslama gerçekleştirdiğimiz tüm izolatlar için gerçekleştirildi (GD1111 = 20631-21, tip izolatının alt kültürü). GD45 ve GD293 dışındaki tüm numuneler için, daha önce tarif edilen bir protokole göre her bir izolat için Illumina endeksli kütüphaneler hazırlandı.⁵⁰ önceki bir çalışmada önerilen değişikliklerle⁵¹. Kütüphaneler daha sonra bir Illumina novaseq 6000 üzerinde Novogene tarafından dizildi (150 bp, eşleştirilmiş uç). GD45 ve GD293 için kütüphaneler sırasıyla TRUSEQ DNA PCR serbest (350) ve Trueseq nano DNA (350) kitleri kullanılarak hazırlandı.

Illumina sekanslama için örnek hazırlama (havuz-seq)

DNA’yı çoklu izolatlardan bir araya getirdik (ek tabloda sunulan menşeleri hakkında detaylar 1) sıralama için numune havuzlarına eşit konsantrasyonlarda. Her bir izolat sadece bir havuzda görünen klape başına toplam dört havuz hazırlandı. İçin PD-1, toplam 69 izolat kullanıldı (havuz boyutları: 17, 17, 17 ve 18 izolatlar), oysa PD-2, toplam 63 izolat kullanıldı (havuz boyutları: 15, 16, 16 ve 16 izolatlar). Klapeler içinde izolatlar, ekstraktlarının DNA konsantrasyonu temelinde bir havuza atandı (yani, en yüksek DNA konsantrasyonuna sahip 17 ve 15 izolatlar PD-1 ve PDSırasıyla -2 birlikte toplanmıştır). Her havuz tarafından üretilen sonuçların ayrı ayrı ve birleşik veri kümesinin tutarlılığını doğrulamak için numuneleri klavya başına dört havuza havuzlama stratejisi kullanılmıştır (bkz. ‘Genotipleme’ bölümüne bakın). İzolatlar, hem bölgeler arasındaki coğrafi mesafeyi hem de her klondaki genotipik zenginliği en üst düzeye çıkarmak için seçildi. Her bir izolatın DNA ekstraksiyonundan (ve nicelleştirilmesinden) sonra DNA, havuz başına 60 uL hacimde toplam 500 ng DNA ile eşit izolat konsantrasyonları ile sonuçlanacak şekilde birleştirildi. Yayınlanmış bir protokole göre her havuz için Illumina endeksli kütüphaneler hazırlandı (yani izolatlar havuz-seq için ayrı ayrı endekslenmedi)⁵⁰ daha önce önerildiği gibi değişikliklerle⁵¹. Kütüphaneler daha sonra Novogene tarafından Illumina Novaseq 6000’de Novogene tarafından dizildi (150 bp, eşleştirilmiş uç).

Multilocus genotiplerinin analizleri

Multilocus genotiplerinin (MLG’ler) analizleri R’de gerçekleştirildi (v.4.1.1)⁵²belirli analizler için paketler kullanılarak tahmini etkili göç yüzeyleri (EEM’ler) hariç. Özellikle, POPPR paketi (v.2.9.3)⁵³ klonal üreme ile haploid türlerin popülasyon genetik analizleri için gerekli araçları sağladığı için yaygın olarak kullanıldı ( P. yıkım).

MLG’ler, 18 polimorfik mikrosatellit lokuslarında benzersiz alel kombinasyonları ile tanımlandı. Bu işaretleyici seti, MLG’lerin hem MLG’lerin genellikle daha az farklılaştığı siteler arasında hem de içinde kimliğini güvenilir bir şekilde tanımlamak için yeterlidir.³⁴. Tüm izolatlarda, alelik zenginlik, lokus başına 10 ila 93 alel arasında değişen yüksekti (ortalama = 37); Ancak, bazı alellerin sabitlendiğini bulduk. PD-2 klon (Ek Tablo 6). Analizler için sadece maksimum 4 eksik alel (yani 14 mikrosatellitte başarılı bir şekilde genotipli) olan izolatlar kullanıldı, bu da 5.479 izolat içeren bir veri kümesiyle sonuçlandı.

İzolatlar arasındaki farklılaşmayı görselleştirmek için ana bileşen analizi (PCA) kullanıldı (paket adeegenet (v.2.1.5)⁵⁴). PCA’ların sonucu örnekleme yoğunluğuna bağlı olduğundan⁵⁵Avrasya’daki farklılaşmalarını yakalamak için klapeler arasında kabaca eşit örnek boyutları seçmek önemliydi. Bunu başarmak için 51 site seçtik (aynı sayıda site PD-2 bulundu) PD-1, aralarında coğrafi mesafeyi (yani, inceltme alanlarını) en üst düzeye çıkaracak ve site başına 20’ye kadar izolat kullanacak şekilde (yine, siteler arasındaki örneklemenin belirgin şekilde düzensiz olmamasını sağlamak için). Bu, 234 ve 92 izolat içeren bir veri kümesiyle sonuçlandı. PD-1 ve PD-2 sırasıyla, her biri 51’den fazla site (yalnızca benzersiz MLG’ler kullanarak). PCA daha sonra bu kullanılarak gerçekleştirildi PD-1 veri kümesi alt kümesi ve tam veri kümesi PD-2. Sonuçlar tamamen farklılaşan iki küme ortaya çıktı. Kuzey Amerika izolatlarının PCA grafiği üzerindeki konumu, ‘suprow’ işlevini kullanarak koordinatlarını yansıtarak veya tahmin ederek bir posteriori belirlenmiştir. Siteler arasındaki mesafeyi en üst düzeye çıkarmanın da bir etkisi olabileceği düşünüldüğünde, 51 siteyi rastgele alt örnekleyerek Avrasya veri kümesindeki bu bulguları doğruladık. PD-1 tekrar tekrar (100.000 kez, ancak saha başına izolat sayısı hala 20’de kapatılmıştır) seçilen siteler arasındaki coğrafi mesafeyi dikkate almadan. Bu 100.000 alt örneklenmiş PCA’yı çalıştırdıktan sonra ( PD-2 değişmeden, coğrafi olarak inceltilmiş PCA çalışması ilave edildi, bu da toplam 100.001 PCA ile sonuçlandı), PC1 için gözlemlenen değerlerin yoğunluğu, inceltilmiş veri kümesi için elde edilen değerlerle tutarlıydı, bu da farklılaşma sinyali, farklılaşma sinyali, PD-1 ve PD-2 güçlü ve seçilen alanların coğrafyası veya kimliğinden bağımsızdı (Şek. 1b).

Ayrıca, keşfedilen klapelerin her birinde popülasyon farklılaşmasının varlığını araştırmak için mikrosatellit veri kümesini kullandık. Bu amaçla, sadece Avrasya izolatlarını (yani, 33 izolat hariç) araştırdık ve tedavi ettik. PD-1 ve PD-2 ayrı ayrı.

İlk olarak DAPC kullandık³³ (paketini kullanarak) her bir izolat örneklenen tüm Avrupa siteleri arasında bir siteye atamak. Farklı sitelerden gelen popülasyonlar genetik olarak farklılaşırsa, DAPC’nin gerçek menşe alanlarına (yani örneklendikleri yerlerde) izolatları şans eseri daha sık ataması beklenir. Burada her bir izolat, gözlemlenen alel frekanslarına göre alanlara olasılıkla atandı (örneğin, lokusların bağımsızlığı hakkında herhangi bir varsayım yapılmamıştır). Her izolat bağımsız bir DAPC’de çalıştırıldı, bu da 2.191 ve 279 DAPC seti ile sonuçlandı. PD-1 ve PD-2, sırasıyla (Kuzey Amerika’dan gelen tüm izolatlar hariç ve site başına sınırlı 20 izolatla, ayrıca bkz. Ek Tablo 1; 120 PCA ekseni ve 100 ayrımcı analizi (D_A) tüm koşularda tutulan eksenler). Bazı izolatlar her zaman şans eseri doğru bir şekilde atanacağından, gözlemlenen alel frekanslarına dayalı doğru atamalara kıyasla doğru atamaların yüzdesini tesadüfen ölçmek önemliydi. Bu nedenle, şans eseri meydana gelen doğru atamaların sıklığını ve izolatların menşe bölgesi ile atanan alanları arasında beklenen mesafeleri rastgele (randomize DAPC) belirlemek için saha adlarını randomize ettikten sonra (her bir çalışma için bağımsız olarak) aynı DAPC kümelerini çalıştırdık. Atanan siteler ve menşe alanları arasındaki mesafeler, ana makalede sunulmaktadır. PD-1 (Şek. 3b) ve genişletilmiş verilerde Şekil. 9 için PD-2.

Kuzey Amerika girişinin Avrupa kökenli alanlarını tanımlamak için, iki farklı yöntemle iki ayrı analiz gerçekleştirdik: çok değişkenli analizler (DAPC³³) ve mekansal Bayesian çıkarımları (spasiba⁴⁰). DAPC analizleri, veri kümesinde zaten bulunan sitelere örnek atar, oysa SPASIBA yöntemi kullanıcı tarafından tanımlanan aralıkta herhangi bir yere (yani koordinatlar) sürekli atama yapabilir. İlk olarak, 5.162 ile birlikte bir DAPC inşa ettik PDAvrupa’daki 226 alandan -1 izolatları (Ural Dağları’ndaki site hariç tutuldu). Bu DAPC’nin amacı siteleri ayırt etmekti; Bu nedenle, siteler önceden tanımlanmış gruplar olarak kullanılmıştır. Daha sonra, Kuzey Amerika’dan 33 izolatın site üyeliklerini tahmin etmek için AdeGenet R paketinden ‘tahmin.dapc’ işlevini kullandık. Site başına izolat sayısını 20 ile sınırlarken DAPC’yi çalıştırmak aynı atama sonuçları sağladı. İkincisi, Gauss dağılımı ile bir dizi uzamsal olarak otokorelasyonlu rastgele değişkenler tarafından alellerin mekansal frekansını modelleyen jeo -uzamsal atama için bir mekansal Bayesian çıkarım (SPASIBA) yöntemi olan Spasiba modelini kullandık. Uygulama, DAPC analizi için yukarıda açıklananla aynı veri kümesine dayanan spasiba (v.24.6.27) ve INLA (v.0.0.4) paketleri kullanılarak R’de gerçekleştirilmiştir. 5.162 PDReferans verileri (‘Geno.ref’) için Avrupa’daki 226 bölgeden izolatlar ve Kuzey Amerika’daki 9 bölgeden 33 izolat, bilinmeyen coğrafi kökenli bireyler (‘Geno.unknown’) olarak izole. SPASIBA için ‘spasiba.inf’ işlevini 1 ploid seviyesi ve düz bir alan (küre = false) ile kullandık. Düzgün bir uzamsal çözünürlük elde etmek için, ızgarayı boylamda 198 piksel ve enlemde 120 pikselden oluşacak şekilde yapılandırdık. Bu kurulum her iki boyutta tutarlı bir çözünürlük sağladı, her piksel yaklaşık 0.169 ° ‘lik bir çözünürlüğü temsil etti. 33 Kuzey Amerika izolatında çıkarılan en olası tanıtım kaynağını tanımlamak için, 33 izolat boyunca her piksel için ortalama atama olasılığını hesapladık (Ek Tablo 5), temsil için günlük olabilirliği hesapladık (Şek. 4).

EEM’lerin görselleştirilmesi (https://github.com/dipetkov/eems) gen akışı kalıplarına bağlı coğrafi engelleri değerlendirmek için kullanıldı³⁵. Bu yöntem, genetik farklılaşmanın genetik veya genotipik mesafe yerine göç oranlarının bir fonksiyonu olarak görselleştirildiği için PCA’dan farklıdır. Bu yöntem, coğrafi mesafeleriyle (yani, bir izolasyon modeli altında) örneklenen alanda gözlemlenen desenlerle karşılaştırmak için beklenen ikili genetik farklılıkları karşılaştırmak için bir popülasyon genetik model kullanır. Spesifik olarak, coğrafi referanslı örnekleri içeren alan üzerine spesifik yoğunluğa sahip üçgen bir ızgara (demes sayısı) inşa edilir. Her bir ızgaranın kenarı için, geçiş parametresi Bayesian çıkarım ve Markov zinciri Monte Carlo örneklemesi ile tahmin edilir, bu da göçün komşu ızgara hücreleri arasında yaklaşık bir basamak taşı modelinde tahmin edildiği anlamına gelir. Örnekleme konumları ızgara hücre boyutuna bağlı olarak aynı veya komşu hücrelere düşeceğinden, demes sayısı (ızgara hücrelerinin genel yoğunluğunu tanımlamak ve dolayısıyla boyutlarını tanımlamak) tahmini göç oranlarının (özellikle küçük coğrafi ölçeklerde) sonucunu etkiler. Bu nedenle EEM’leri bir dizi DEME boyutu için hesapladık (N= 8, 100–450 demes) her biri 8 milyon iterasyondan bağımsız koşularda (1 milyon yinelemeden sonra), daha önce önerildiği gibi³⁵. Runs, REEMSPLOT2 (v.0.1.0) kullanılarak sağlam geçiş oranlarının görüntülenmesi için tek bir şekilde birleştirildi.³⁵. Tahmini göç oranlarının örnekleme yerlerine en doğru ve seyrek örneklenmiş coğrafi alanlarda daha az doğru olduğu belirtilmelidir. Bu nedenle, saha kimliğine dayalı klon düzeltmesine ek olarak (her genotip saha başına sadece bir kez görünür, ek olaylar çıkarılır), her iki klape için EEM’ler hesaplanmadan önce Rus izolatları hariç tutulmuştur. Bu, için kullanılan toplam 2.261 izolat ile sonuçlandı PD-1 ve 107 izolatlar PD-2 (Ek Tablo 1). PD10 ve PD14 işaretleyicileri için bilgilendirilmezdi PD-2 ve dolayısıyla EEM’ler için kaldırıldı ( PD16 işaretleyici olan bir veri kümesi bırakan yalnızca -2 veri kümesi).

5.479 izolat (veya 1.866 MLG) arasındaki filogenetik ilişkiler, Nei’nin ‘Da’ genetik mesafesi ve Cavalli -Sforza ve Edwards akor mesafesi ‘DCH’ kullanılarak yeniden yapılandırıldı, çünkü her iki mesafe ölçümü bireyler arasında en iyi performans gösterenler olarak bulundu⁵⁶. Daha sonra genetik mesafeler, phangorn’da uygulandığı gibi UPGMA algoritması kullanılarak kümelendi (v.2.11.1)⁵⁷ R.’de, ilgilenilen düğümlerin topolojisinin her iki yöntemle (veriler gösterilmemiştir) aynı olduğu göz önüne alındığında, sadece DA mesafesinden elde edilen sonuçlar sunulmaktadır. Analizler R’de Hierfstat’ta uygulanan fonksiyonlar kullanılarak yapıldı (v.0.5.11)⁵⁸. Şek. 1bfigtee’nin ‘balık gözü’ fonksiyonu (v.1.4.4.)⁵⁹ ağacın bölümüne yakınlaştırmak için kullanıldı. PD-2 klan. Her ikisinin desteğini test etmek için birer birer lokusları birer birer Jackknifed PD-1 ve PD -2 Maymada ‘IS.monophyletic’ fonksiyonunu kullanan monofili klape (v.5.7.1)⁶⁰.

Uzun okumalardan monte edilen genomların de novo analizi

Temel çağrı

FAST5 dosyalarının temel çağrısı (minion sıralamasından) bir GPU bilgisayarında (Montpellier biyoinformatik biyoçeşitlilik platformu tarafından barındırılmıştır), yazılım Guppy (v.5.0.7) olan ve son teknoloji ürünü bir nöral ağ baz arayanı çalıştırılarak gerçekleştirildi.⁶¹.

Genom düzeneği

Yüksek kaliteli haploid genomları monte etmek için P. yıkım (P. yıkım Haploid), tüm baz denilen okumalarda porechop ile adaptör kırpma gerçekleştirdik (https://github.com/rrwick/porechop)⁶². Bunlar daha sonra Flye’ye ayrıldı (V.2.9)²⁵ -nano-hq bayrağı ile. Diğer argümanlar varsayılan olarak bırakıldı (otomatik minimum çakışmalar dahil). Genomlar, eşleştirilmiş uçlu haritacı burrows-tekerlekli hizalayıcı-maksimal kesin eşleşme, BWA-MEM (v.0.7.17-r1188) kullanılarak ilk haritalamadan sonra Hypo (v.1.0.3) ile önceden kesilmiş Illumina okumaları kullanılarak cilalandı (v.0.7.17-r1188)^63–64. Hipo argümanları yaklaşık 35 megabaz genom uzunluğunu içeriyordu (-s 35m; önceki bir çalışmaya dayanarak⁶⁵) ve her bir genomun (-c) ortalama okuma derinliği (Samtools derinliği ile hesaplanır⁶⁶).

Potansiyel olarak kontaminasyondan kaynaklanan contig’leri kaldırmak için, son derece düşük GC içeriğine sahip contig’ler (Infoseq kabartması kullanılarak tanımlanır (v.6.6.0.0)⁶⁷) nükleotid patlama veritabanı ile ayrı ayrı karşılaştırıldı^68–69. Bu sonuçlara dayanarak, P. yıkımdört izolattan ( Selülosimikrobiyum cellulans– Penisillium her zamanki – Pyrenophora teres f. teresVe Shiraia Bambusicola ).

Karakteristik daha düşük GC içeriği ve bilinen uzunluk (yaklaşık 32 kb) ile mitokondriyal kontigler de patlama yoluyla tanımlanmış ve tüm diğer analizlerden çıkarılmıştır. Sahte montajdan kaynaklanan genomlarımızdaki gürültüyü gidermek için, 10.000 bp’nin altındaki tüm contig’ler Seqkit kullanılarak çıkarıldı (v.0.16.1)⁷⁰ (-m 10000). Birleştirilen genomların istatistikleri ek tabloda sunulmaktadır 11.

Ek açıklamayı tekrarla

Her bir genomun tekrar içeriğini tekrarlama ve repenmasker araçlarıyla açıkladık. Yapı veritabanını, 11 genomun hepsinde ayrı ayrı çalıştırdığımız RepourModeler (v.2.0.1) izledi. P. yıkım Varsayılan parametrelerle tekrar bölgeleri tanımlamak için izolatlar. Tüm yeni konsensüs tekrar dizileri, kümelenmiş kütüphanedeki fazlalığı ortadan kaldırmak için CD-HIT-EES (v.4.8.1) kullanılarak birleştirildi.⁷¹ (-C 1 -r 1 -g 1 -p 0 olarak). Açıklanmayan tüm son tekrar dizileri daha sonra tekrar kütüphanesinden çıkarıldı. Ayrıca, tekrar kütüphanenin Blastn (v.2.9.0+) aramaları, 9.405 açıklamalı protein kodlayan genlere karşı gerçekleştirildi. P. yıkım NCBI’dan (gcf_001641265.1_asm164126v1) indirilen referans genom montajı. Sorgu uzunluğunun% 80’inden fazlası için% 80’in üzerinde bir dizi kimliğine sahip herhangi bir tekrar (-Outfmt 6, -Perc_identity 80, QCOV’ların manuel olarak çıkarılması> 80) de kaldırıldı.⁷². Son olarak, Samtools (FAIDX) ile çoğaltılmış Fasta girişlerini kaldırdık. Maskeli montajlar, aşağı akışta kullanıldığı gibi Repenmasker (v.4.1.2) kullanılarak üretildi⁷³ (-xsmall) küratörlü tekrar kütüphanesi (-pa 5 -a -s -gff -no _is) ile. Daha sonra aynı boru hattı, bağımsız olarak muamele edilen dış grup (GD267) için kullanıldı. P. yıkımizolatlar.

Genom ek açıklaması

Tüm izolatların gen ek açıklaması için, özellikle mantar genom ek açıklaması için adanmış Funannotate boru hattını (v.1.8.15) kullanmayı seçtik.⁷⁴. Boru hattını Galaxy Europe kümesi aracılığıyla kullandık (https://usegalaxy.eu). Tüm genom tertibatlarını Repenmasker araçlarını kullanarak yumuşak maskeleyerek başladık (v.4.1.2; https://www.repeatmasker.org/repeatmasker/)⁷³ Bu çalışmada oluşturulan transpoze edilebilir eleman (TE) kütüphanesi ile (bkz. ‘Tekrarlanma Ek’ bölümüne bakın). Daha sonra Avrupa’dan Illumina eşleştirilmiş RNA sekanslama verilerini kullandık (Sıra Okuma Arşiv Efsanemleri SRP041673 Ve SRR1270711) ve Kuzey Amerika izolatları⁷⁵ (APR041668– SRR1270148– SRR1270408 Ve SRR1270412) verilere ek olarak P. yıkım Enfekte yarasalar⁷⁶ (SRP055976) yayınlanan referans dizisinin ek açıklaması için kullanılır⁷⁴. Tüm RNA sekansı eşleştirilmiş okumaları daha sonra RNA yıldızı eşleme aracı (v.2.7.10b) kullanılarak yumuşak maskeli genom düzenekleri üzerinde eşleştirildi⁷⁷ (–genomesaindexnbases 11bp). Funannotate-Predicc, Augustus (v.3.4.0) kullanılarak okuma eşlemesine dayalı gen modellerini döndürür. Ayrıca, olası gen yapılarını tahmin etmeye yardımcı olmak için proteinler için küratörlü veritabanları (unIPROTKB/Swissprot Dativank) kullanır. Öngörücülerin ilk eğitimi için Funannotat-Predicc ayrıca Busco’yu kullanır (v.5.2.2)⁷⁸ İlk Augustus tür eğitimi için. Bu adım için, Galaxy Server: Fusarium’da bulunan filogenetik olarak en yakın türleri kullandık (Orthodb v.10). Seçenek parçalanmış gen modelleri oluşturduğu için mantar genomlarına adanmış ab initio öngörücüsünü kullanmadık. Funannotat teminatının sonuçları, funannotat-fonksiyonu kullanılarak fonksiyonel genom ek açıklamaları oluşturmak için birleştirildi. Üretilen protein kanıtları Funannotate veritabanı ile karşılaştırıldı (v.2022-01-17-193541).

Genler arıyorum

Her bir izolat için genom düzeneği, ortodb’den (V.10) Krallık mantarları için -m genom bayrağı kullanılarak Busco (V.5.2.2) (V.5.2.2) (HMMMSearch V.3.1 ve Metaeuk V.5.34C21F2) ile karşılaştırıldı. Mantar veritabanı 758 ortolog gen dizisi içerir^79–80. Nanostat ve nanoplot ile temel okuma istatistikleri elde edildi (v.1.42.0)⁸¹.

Sekans sapması

Busco genleri için sekans farklılığı, maft hizalamasından (aşağıda açıklanmıştır) R’deki Maymun paketinden ‘dist.dna’ işlevi ile hesaplanmıştır.⁶⁰. Tam genomların birleştirmelerinin her biri için, subcontigs, tekrarlanan ve düşük karmaşıklık dizilerinin tekrarlanan ve tekrarlamacı boru hatları kullanılarak tespit edilen (yukarıda tarif edildiği gibi) silinerek elde edilmiştir. Subcontigs’in yerel bir hizalaması nükmer 4 ile gerçekleştirildi (v.4.0.0)⁸² Birbirlerine karşı tüm izolatlar için ve%80 oranında minimum dizi kimliği uygulayarak Show-Coords programı kullanılarak yorumlandı. Hizalanmış bölgeler, ağırlıklı ortalama kimliği hesaplamak için kullanıldı.

Sindirim

Klapeler arasındaki genomik yapı ve organizasyondaki benzerlikler ve farklılıklar hakkında daha iyi fikir edinmek için ağ tabanlı mikrosinteni analizi gerçekleştirdik. Bu, gen-kopya sayısını araştırmamızı, sinteninin korunmasını tanımlamamızı, klaviye özgü sintenik kümeleri tespit etmek ve ölçmek ve mikrosintenine dayalı izolatlar arasındaki filogenetik ilişkileri yeniden yapılandırmamızı sağladı. Sintenik blokların tespiti, de novo (yani referans olmadan) birleştirilmiş yüksek-sınırlı genomlar kullanılırken en iyi performans gösterir. Daha önce yayınlanmış bir sistematik değerlendirmeye göre⁸³genomlarımızın özellikleri (ortalama 1.8 mb; gen yoğunluğu, MB başına 270 civarında tahmin edildi: 10.000 gen ve genom başına 36.9 MB; Ek Tablo 11) sağlam bir synteny analizine izin vermelidir.

11’den ek açıklamalı genler kullanmaP.  yıkımGenomlar (‘genom düzeneği’ bölümünde detaylandırılmıştır), tüm büyükler arası ve çiftler arası tüm vs-all protein benzerlik aramaları, en iyi 5 isabetin aramalarda tutulduğu elmas (v.2.1.7) kullanılarak yapıldı⁸⁴. Diamond tarafından üretilen çıktı McScanx algoritması için girdi olarak kullanıldı⁸⁵ Çift Synteny Blocks Tespiti gerçekleştirmek için. McScanx için kullanılan parametrelerin sonuçlarımız üzerinde hiçbir etkisi olmadığını doğrulamak için, 25 farklı parametre ayarı altında mikrosynteny blok algılama (ve tüm akış aşağı analizleri) gerçekleştirdik 17). Bu parametre ayarları, McScanx’ın iki temel parametresini, yani bir sintenik bloğu (-s, Mach_size: 10, 15, 20, 25, 30) çağırmak için gerekli minimum sayıda gen (ankraj) ve ankrajı (-m, maks_gaps: 15, 20, 25, 30, 35) aramak için içeriyordu. Sintenik bloklarda tanımlanan tüm sintenik genler, Infomap algoritması kullanılarak bir mikrosynteny ağı oluşturmak için kullanıldı (R paketi sintenetinde infoNtenet işlevinde uygulandı (v.1.8.1)⁸⁶Synteny Networks için mevcut en iyi kümeleme yöntemi olduğu gösterilmiştir⁸⁷. Synteny ağında, genler düğümleri temsil eder ve genler arasındaki sintenik ilişkiler düğümleri bağlayan kenarlarla temsil edilir. Parametre ayarları arasında ortalama ortalama kümeleme katsayısı 0.95 elde edildi (Min – MAX:%0.94-0.95; Ek Tablo 17), genlerin sintenik komşuları ile birden fazla genom boyunca tam bir alt grafik veya küme oluşturma eğiliminde olduğunu ortaya koymuştur. Daha sonra filogenomik profil oluşturma, çıkarılan sintenik kümeler kullanılarak yapıldı, bu da bir M matrisine neden oldu_IJ kümeden gen sayısını temsil eden filogenomik profillerin Jbu genomda bulunabilir Ben. Korunmuş ve klana özgü kümeleri koruyan sinteny kümelerini ortaya çıkarmak için kümeler, Öklid mesafesinin bir matrisi üzerinde Ward’ın kümelenmesi kullanılarak kümelenmiş kümelerle bir ısı haritası olarak görüntülendi (Şekil. 2E). Synteny ağında bulunan filogenetik sinyal, 11 genomun mikrosintenine dayalı bir filogeni çıkarmak için kullanıldı. Binarize filogenomik profillerin matrisi, MK + FO + R modelini iki yöntemle değerlendirilen düğüm desteği ile uygulamak için kullanıldı: SH benzeri yaklaşık benzerlik oran testi için 1.000 bootstrap replikat ve 1.000 kopya. Orta nokta yöntemi, ‘phangorn’ paketindeki ‘orta nokta’ işlevi kullanılarak ağacı köklendirmek için uygulandı⁵⁷ ve klapeler için monofili PD-1 ve PD-2, ‘Monophy’ (V.1.3.2) ‘de’ Değerlendirmemonofi ‘fonksiyonu kullanılarak değerlendirildi.⁸⁸.

Illumina okumalarının analizleri (ayrı ayrı etiketlenmiş izolatlar)

Veri Kontrolü ve Eşleme

18 izolat için Illumina dizileri mevcuttu (Ek Tabloda listelenmiştir 10). PHRED kalite değeri 30’dan (‘-q 30’) sahip bazları çıkarmak için FastP (V.0.23.4) kullanıldı. Daha sonra, Illumina okumalarını iki referans genomun her birine hizalamak için Bwa-MEM2 (v.2.2.1) kullanıldı (GD293 PDİçin -1 ve GD45 PD-2). Samtools görünümü (v.1.16.1) sadece eşlenmiş (-f 0 × 4), uygun şekilde eşleştirilmiş (‘-f 0 × 2’) ve yüksek güven eşleme kalitesi (MAPQ değerleri 60: ‘-q 60’) ile okumaları korumak için kullanıldı. Samtools sıralaması ve Samtools endeksi, elde edilen BAM dosyalarını sıralamak ve dizine eklemek için kullanıldı. Okumalar Picard (V.2.27.1) ve AddorReplacerAdGroups aracı kullanılarak atandı. Markduplicates aracını (Picard’dan) kullanarak yinelenen okumaları kaldırmadan önce bam dosyasını queryname (qName) ile sıralamak için SORMMAM aracı (Picard’dan) kullanıldı. SortRam, daha sonra SamTools endeksini kullanarak dizine eklemeden önce koordinatla BAM dosyasını sıralamak için kullanıldı.

Taban arama, genotipleme ve filtreleme

Daha sonra ‘-erc BP_Resolution’ modunu kullanarak ‘GATK V.4.2.6.1) (GATK V.4.2.6.1) ile temel çağrı gerçekleştirdik ve 1. genotipleme ploidini’ GATK genotypeGVCFS ‘ile yapıldı. Daha sonra bir dosyadaki değişken olmayan konumları ve başka bir dosyadaki değişken konumları (yalnızca SNP) (eklemeler ve silmeler atıldı) ‘Gatk SelectVaryts’ kullanıldı. ‘Qual <30.0', 'Qual/DP 3.0’, ‘FS> 60.0’, ‘DP <20.0' ve 'MQ <40.0' kriterlerini karşılamayan değişken konumların sert filtrelemesi, 'Gatk Varyantfiltration' ve 'Gatk Selecvariany' kullanılarak gerçekleştirildi. Belirli bir konumda 20 × 'den düşük bir okuma derinliğine sahip genotipleri izole etmeyin. Daha sonra filtrelenmiş değişken ve değişken olmayan konumları tek bir VCF dosyasında birleştirmek için 'GATK sortvcf' kullanıldı. 'Bedtools çıkarma' daha sonra, izolatları diploid olarak düşünüldüğünde heterozigot olarak adlandırılan referans genomdan ve konumlar olarak adlandırılan pozisyonları çıkarmak için kullanıldı (bkz. 'Tekrarlayan DNA'yı filtreleme' bölümüne bakınız).

İki referans genomunun (GD293 ve GD45) her bir contig için, daha sonra, 18 izolatları her bir referans genomuna eşleştirirken, yukarıda tarif edilen filtrelerimizi gerçekten geçiren bölgelerde tekrarlayan sekansların varlığını gösteren alışılmadık derecede yüksek okuma derinliğini tespit etmek için ortalama okuma derinliğini kontrol ettik. Her bir contig için, yüksek düzeyde eksik verilere sahip contig’leri tanımlamak için pozisyon başına eksik verilerle ortalama izolat sayısını da kontrol ettik. GD45 için, 50 kb’den küçük sekiz contig’den ikisinin haritalanması yoktu ve geri kalan altı kişiden beşinde olağandışı ortalama okuma derinliği (diğer contig’lerden daha düşük veya daha yüksek) ve/veya eksik verilere sahip yüksek ortalama izolat sayısına sahipti. 12). Bu nedenle, GD45 genomunun toplam% 0.46’sını temsil eden 50 kb’nin altındaki sekiz kb’nin tümü analizlerden çıkarılmıştır. GD293 için, tüm contig’ler 50 kb’den büyüktü ve diğer contig’ler için gözlemlenen değerlerden sapan tek bir contig (contig_44), diğer kontiglerden yaklaşık 100 × daha yüksek bir okuma derinliğine sahip olarak ve konum başına eksik verilerle ortalama 13 izolatlara sahip (Ek Tablo 12). Bu nedenle, büyük olasılıkla tekrarlayan sekanslara sahip bir aksesuar kromozomu, bu nedenle daha ileri analizlerden çıkarılmıştır. Tüm filtreleme aşamaları yapıldıktan sonra (Ek Tablo 13), ortalama okuma derinlikleri, GD293 ve GD45 üzerinde eşlenirken sırasıyla 237 ve 240 idi. GD293 ve GD45 üzerinde haritalandığında 18 genomun okuma derinlikleri arasındaki korelasyon 0.996 idi (Spearman’ın rütbe korelasyonu R; P <0.001), haritalamanın her iki referans genomunda da eşit derecede iyi çalıştığını vurguladı.

Ortalama olarak, her izolat pozisyonların% 95’inden fazlası için bir genotipe sahipti (Ek Tablo 13). Sonunda, GD293’ü referans olarak (92.593 bialelic SNP dahil) ve GD45’i referans olarak kullanırken 22.041.192 pozisyon kullanırken 21.609.224 pozisyon hakkında veri elde ettik (95.638 bialelik SNP’ler dahil). Bu veriler referans genom başına tek bir VCF dosyasında (18 numuneli) saklandı. Ayrıca, tam prosedürümüzün kalitesini değerlendirmek için, GD293’ün Illumina okumalarını de novo-montajlı minion genomuna haritalayarak elde edilen farklılık sayısını kontrol ettik (referans genom GD293, montaj detayları için ‘genom montajı’ bölümüne bakın). GD45 referans genomuna eşlenmiş GD45 için benzer bir analiz yaptık. GD293 için, referans genom (kendisi) ile olan farklılık sayısı, son VCF dosyasındaki 23.660.591 pozisyondan 19 varyanttı, bu da 8.030231 × 10 kombine eşleme, baz arama ve genotipleme hata oranını gösterdi^–7; Bu, 1.245.294 bp’lik bir 1 hatadır, bu da Q60.95’in kalite puanına karşılık gelir. GD45 için (referans genom GD45 üzerinde haritalandı), hata oranı da son derece düşüktü: 2.444712 ​​× 10^–6 (22.088.490 bp üzerinden 54 varyant) veya her 409.046 bp’de 1 hata (Q56.11). Bu veriler, birkaç katı filtre içeren boru hattımızın büyük miktarda veriyi korurken (referans genomların yaklaşık% 60’ını oluşturan> 22 MB) yüksek derecede güvenilir SNP’leri geri kazandığına dair kanıt sağlar.

Çeşitlilik ve farklılaşma hesaplaması

Genetik çeşitlilik π klavya başına hesaplandı (11 için PD -1 ve 7 PD-2) Pixy (v.1.2.7.beta1) kullanarak 50 kb pencerede, hesaplamalarda eksik verileri dikkate alır ve dolayısıyla tarafsız tahminler sağlar⁸⁹. Genetik farklılaşma indeksi (F_ST; Weir ve Cockerham yöntemi) İki klape arasındaki vcftools’un değiştirilmiş bir sürümü kullanılarak hesaplandı (https://github.com/jydu/vcftools) istatistiklerin haploid verileri ile hesaplanmasına izin vermek için.

Filogenetik ilişkiler

18 arasındaki ilişkilerP.  yıkımİzolatlar (Ek Tablo 10) ve Psödogymnoascus sp. Dış grup (izolat 267), IQ-Tree2’de maksimum olasılık kullanılarak yeniden yapılandırıldı (v.2.0.6)⁹⁰. İlişkiler, genomu bölmek için iki yöntem düşünüldüğünde yeniden inşa edildi: (1) sadece Busco genleri ve (2) tüm genom boyunca 10 kb pencereler. Bu bölüm yöntemlerinin her biri, iki referans genomun her biri (GD293 ve GD45; bkz. ‘Veri Kontrolü ve Eşleme’ bölümüne bakınız), bu da toplam dört veri kümesiyle sonuçlandı. Dört veri kümesi de aynı topolojiye doğru birleşti ve iyileşti PD -1 ve PD -2 karşılıklı olarak iki monofilik klape olarak (Şek. 2b ve Ek Şek. 5).

Busco filogeni

Filogenetik ağacı, izolatların yeni sıralanmış ve halka açık Busco genlerini kullanarak üretmek için, 18 izolatın hepsinde ortak olan mantar ODB10 veritabanından tanımlandığı gibi tüm tek kopya, tam ortologları kullandık (Ek Tablo 11) vePsödogymnoascus sp. Dış grup (GD267’yi izole). Bu, sırasıyla GD293 ve GD45 üzerinde eşlendiğinde 664 ve 662 Busco geniyle sonuçlandı. Her bir montajdan gelen genleri bedtools ile çıkardık (v.2.30.0-8)⁹¹ Mafft ile ayrı ayrı hizalanmadan önce Getvasta komutunu kullanarak (v.7.453)⁹² (–Auto,-AdjustDirection). IQ-Tree2’de, 1.000 ultrafastlı bootstrap (-b 1000 -t otomatik) ile kenar bağlantılı orantılı bölme modeline sahip birleştirme bazlı bir tür ağacı üretildi⁹³. Şecere ilişkilerinin farklı lokuslarda ne kadar tutarlı olduğunu ölçen tür uyum faktörünü üretmek için, ortolog ve tür ağaçları IQ-Tree2 tarafından kullanıldı (–scf 100-prefix concord -t 10). Son ağaç manuel olarak Figtree’deki GD267 dış grubuna kök salmıştır (v.1.4.4; http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/). Gen ağaçları arasındaki çelişkili filogenetik sinyalleri temsil etmek için (örneğin, rekombinasyon ve/veya eksik soy sıralaması nedeniyle), Phangorn R Paketinden Concsusnet fonksiyonunu kullandık.⁹⁴ ve konsensüs ağını farklı gen ağaçlarında meydana gelen bölmelerden hesapladı. Ağda sadece ağaçların en az% 10’unda meydana gelen bölmeler temsil edildi.

Bütün genom filogeni

18 arasındaki ilişki P.  yıkımİzolatlar (Ek Tablo 10) ve Psödogymnoascussp. Dış grup (izolat 267), IQ-Tree2’de maksimum olasılık kullanılarak yeniden yapılandırıldı (v.2.0.4)⁹⁰. 19 (18 + 1) bireylerin genotiplerini içeren VCF dosyasından saha başına eksikliği çıkarmak için ‘eksik site’ fonksiyonuna sahip VCftools kullandık (bkz. ‘Baz çağrısı, genotipleme ve filtreleme’ bölümüne bakın). Daha sonra, 10 kb üst üste binmeyen pencerelerin üzerinde eksik veri olmayan konum sayısını hesapladık ve yalnızca 19 izolatta eksik veri olmadan en az 5.000 konumu olan pencereleri sakladık. 19 izolatın her biri için, bu pencerelerden dizileri (fasta formatı) çıkarmak için bedtools getfasta kullandık. Her pencerede, sadece eksik verileri olmayan konumlar (yani minimum 5 kb) tutuldu. Her bir klad, GD293 ve GD45’ten referans genomları kullanırken toplam 1.275 ve 1.288 genomik bölüm elde ettik. Daha sonra 1.000 ultrafastlı bootstrap (-b 1000 -t otomatik) ile kenar bağlantılı orantılı bölüm modeline sahip birleştirme bazlı bir tür ağacı üretildi. Bu prosedür, her klape, GD293 ve GD45’ten (VCF dosyaları) referans genomlar üzerinde eşlenen verilere paralel olarak uygulanmıştır.

Rekombinasyon analizleri

İki klavuzun her birinde rekombinasyon varlığını test etmek için, ikili homoplazy indeksi (phi veya φw) testi ve dört gamete test (FGT) olmak üzere iki test kullandık. Φw testi, yakın bağlantılı siteler arasında çift benzerlik endeksini hesaplar ( wve gözlemlenen değerleri, sitelerin permütasyonundan sonra elde edilen değerlerle karşılaştırır. NO rekombinasyonunun sıfır hipotezi altında, bitişik bölgeler arasındaki soybilimsel korelasyon, sitelerin sırası karıştırılsa bile değişmeden kalır. Bunun nedeni, rekombinasyon olmadığında tüm alanların aynı evrimsel tarihi paylaşmasıdır. Bununla birlikte, rekombinasyon meydana geldiğinde, uzak bölgeler bitişik bölgelere kıyasla daha zayıf soybilimsel korelasyonlara sahip olma eğiliminde olduğundan, sitelerin sırası önemli hale gelir.⁹⁵. Φw testini Splitsstree CE’de uygulandığı gibi kullandık (v.6.3.27)⁹⁶ Sıfır klonalite hipotezini test etmek. FGT testi, aynı contig üzerindeki herhangi bir çift SNP arasındaki alelik kombinasyon sayısının sayılmasını içerir. Sonsuz bir bölge modeli varsayıldığında, dört kombinasyonun gözlemlenmesi, rekombinasyon yokluğu ile uyumsuzdur. Örneğin, iki SNP’nin C/T ve A/G alelleri varsa, CA, CG, TA ve TG haplotiplerinin gözlemi bir rekombinasyon olayının sonucu olmalıdır. Fgt.pl komut dosyasını kullanarak haplotip sayısını hesapladık (https://github.com/dbsloan/fgt). Her klonda, en az 20 kb maskelenmemiş nükleotit pozisyonu ve eksik veri olmayan 100 kb’lik pencerelerde FGT gerçekleştirdik. Bu analizleri, 18 izolattan (11’den 11’ten bireysel olarak etiketlenmiş izolatlardan gelen Illumina verileri) üzerinde gerçekleştirdik ( PD-1 ve 7’den PD-2; ‘Illumina Analizleri (ayrı ayrı etiketlenmiş izolatlar)’) bölümünde açıklanmıştır.)PD -1 vePDSırasıyla -2 klape.

Daha sonra, nüfus rekombinasyon oranını tahmin ettik ( R = 2 N_eRNeresiRnesil başına bp başına rekombinasyon oranıdır veN_e etkili nüfus büyüklüğü) ldhelmet yazılımı kullanıyor⁹⁷ (V.1.10; https://github.com/popgenmethods/ldhelmet). Popülasyon mutasyon oranı için -t 0.0005 ve -t 0.001 parametrelerini kullandık ( Q= 2 N_eMNeresi Mnesil başına bp başına mutasyon oranı) PD-1 ve PD Sırasıyla -2, -w 200 ve IQTREE2 ikame modeli GTR’yi kullanarak mutasyon geçiş matrisini tahmin ettik⁹⁸. Varsayılan değerler, LDhelmet kılavuzunu izleyen diğer parametreler için kullanıldı.

Yukarıda açıklandığı gibi yapılan resmi rekombinasyon testlerinin yanı sıra, iki çiftleşme türünü haritalamak için mikrosatellit verileri (‘multilocus genotiplerinin analizleri’ bölümünde tarif edilen) ile elde edilen yeniden yapılandırılmış filogenetik ağacı kullandık. Bu analiz, her iki çiftleşme tipinin varlığını gösterdi PD-1 ve PD-2 klapeleri ve her iki klavya arasındaki MLG’ler arasındaki ilişkileri tasvir eden filogenetik ağaç boyunca her iki çiftleşme tipinin varlığı. Bu veriler, rekombinasyon için daha fazla kanıt sağlar PD -1 vePD-2 klape (Ek Şek. 1).

Demografik tarihin modellenmesi

Her iki klonun evrimsel tarihini modellemek için, çağdaş göçü olan ve olmayan iki demografik model karşılaştırarak yaklaşık Bayes hesaplaması uyguladık. Özellikle, izolasyon-göç modelini (IM) ve katı izolasyon modelini (SI) değerlendirdik. Bu iki model, bir seferde bölünmüş bir nüfusun T_bölmek geçmişte, ancak bu olayı IM modelinde sürekli geçiş izler veya SI modelinde göç yoktur. Ataların nüfusu ve türetilmiş nüfus bağımsız nüfus büyüklüğüne sahiptir ( N_A– N₁ Ve N₂). Nüfus büyüklüğü, nüfus 1 ve 2’de bir kez bağımsız olarak değişmekte özgürdür T_DEM1 Ve T_Dem2 Geçmişte sırasıyla nüfus 1 ve 2 için. MSNSAM (Ekim 2007 versiyonu) kullanılarak birleşme simülasyonları üretildi⁹⁹MS’in değiştirilmiş bir versiyonu olan¹⁰⁰. Nüfus büyüklüğü için öncelikler, T_bölmek ve göç oranı, düzgün dağılımlar kullanılarak üretildi. Priors ve özet istatistikler, dillerden alınan komut dosyaları kullanılarak hesaplandı¹⁰¹ (https://github.com/popgenomics/dils_web). 1.5 × 10 mutasyon oranı kullanılarak her iki model için bir milyon simülasyon yapıldı^–9 Site başına mutasyon başına mutasyon, mutasyon oranının bir rekombinasyon oranı, bir T_bölmek 10 ila 10 milyon kuşak ve bir Nnüfus başına 10 ila 10 milyon kişi. Tam genom üzerindeki analizlerin gerçekleştirilmesi hesaplama açısından çok yoğun olacağından (simülasyon bölümü için), bunun yerine genom boyunca temsili bir örnek kullandık. Bunu başarmak için, 10 kb aralık aralıklı 1 kb dizi penceresini seçtik. Bu, veri kümeleri için 4.832 ve 2.881 pencere veri kümesiyle sonuçlandı. PD-1 ve PD-2 Referans genomları sırasıyla.

Model seçimi, R paketi ABCRF’de (v.1.9) uygulanan rastgele orman yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi.¹⁰² ve R paketi ABC’nin POSTPR işlevini kullanarak (v.2.2.1)¹⁰³. Parametre tahminleri, 5.000 simülasyon kullanılarak ABC paketinde uygulanan sinir ağı yöntemi kullanılarak elde edildi. Son olarak, özet istatistiklerin her biri için bir uyum iyiliği istatistiği, posterior dağılımların simülasyonlarının, bu oranla gözlemlenen istatistiğin üstün veya daha düşük bir istatistikiyle hesapladık. PHer zaman 0.5’ten daha küçük.

Model seçim prosedürü, GD293 ve GD45 referansları için rastgele orman yöntemi ile sırasıyla 0.77 ve 0.75 posterior olasılıklarla SI modelinin seçimine yol açmıştır. Reddetme yöntemi, GD293 ve GD45 referansı için SI modelinin sırasıyla% 79 ve% 76’sının seçimine yol açtı. Bu nedenle, her iki model seçim yöntemi de çağdaş göç olmadan modeli desteklemektedir. Nöral Ağ Yöntemi kullanılarak SI modelinin arka dağılımlarından tahmin edilen tam parametre seti ek tabloda sunulmaktadır. 16. SI modeline dayanarak, PD-1 ve PD-2 klonun 114.000 ile 1.5 nesil önce gerçekleştiği tahmin edildi (Ek Tablo 16).

Illumina Reads analizi (havuz-seq verileri)

Veri Kontrolü ve Eşleme

Yukarıdaki Illumina okumaları için ‘Veri Kontrolü ve Eşleme’ bölümünde ayrıntılı olarak ayrıntılı olarak Illumina verilerini (klan başına dört havuzun her biri) kontrol ettik ve eşleştirdik.

Veri havuzlama

Her biri için PD-1 ve PD-2, dört havuzumuz (bundan sonra ‘alt pooller’ olarak adlandırılır) izolatlarımız (17, 18, 17 ve 17 izolatları ile PD-1 ve 16, 16, 16 ve 15 izolatlar PD-2). Klape başına dört alt poolü birleştirmeden önce, alt pool başına okuma sayısını hesapladık ve her bir alt poolda izolat başına aynı sayıda okuma (1.704.260 okuma) için Samtools görünümü ile alt örnekledik. Daha sonra Samtools birleşmesini klavuz başına dört alt pool için birleştirmek için kullandık, bu da 69 izolatın bir son havuzu (dört alt pool havuzu) ile sonuçlandı. PD-1 (117.589.122 okuma) ve 63 izolatın bir son havuzu (dört subpools havuzu) PD -2 (107.355.848 okur).

Genotipleme

Her havuz için genotipleme ayrı ayrı yapıldı ( PD -1 ve bir PD -2), Clade 1 ve 2’den gelen referans genomu üzerinde haritalanmıştır, bu da dört ayrı analiz ile sonuçlanmıştır. Samtools mpileup daha sonra BAM dosyalarından kazık çıkışları oluşturmak için kullanıldı. SNP çağrısı için, özellikle havuzlar için tasarlanmış bir Bayesian yaklaşımı uyguladık (SNAPE-Havuzlanmış^104–105) bir sitenin polimorfik olma olasılığını hesaplayan. Bu yaklaşım hem simülasyonlar hem de ampirik yaklaşımlar kullanılarak doğrulanmıştır ve şu anda mevcut olan en iyi performans yöntemi arasındadır.¹⁰⁴. Snape-havuzlanmış önceki parametreler aşağıdaki gibi ayarlanmıştır: th = 0.0005, D= 0.0025 veya D= 0.0005 Sırasıyla farklı ve aynı klondan referans üzerinden havuzun eşlenmesi sırasında, prior = ‘bilgilendirici’, kat = ‘katlanmış’ ve nchr = havuzdaki (haploid) izolat sayısı. Snape-havuzlanmış çıkış dosyasını bir VCF’ye dönüştürdük ve program geliştiricileri tarafından önerildiği gibi, sadece posterior olasılığı ≥0.9 olan pozisyonları polimorfik olarak kabul ettik. Diğer tüm durumlarda pozisyonlar monomorfik olarak işaretlendi. Sıralama hatalarını nadir aleller olarak dahil etmekten kaçınmak için iki tamamlayıcı stratejiyi benimsedik. İlk olarak, Snape-Havuzlanmış Çıktıyı bir VCF’ye dönüştürürken, yalnızca havuzda en az beş okuma ile desteklenen alelleri (yani, dört alt pool) dahil ettik. İkincisi, iki alt poolda en az iki okuma ile desteklenmeyen alelleri tanımlamak için her bir alt pool üzerinde (yukarıda açıklandığı gibi parametrelerle) SNAPE-Havuzlanmış analizler gerçekleştirdik. Bu aleller daha sonra havuzun VCF dosyasından çıkarıldı.

Veri filtreleme

Yanlış pozitif SNP’leri sınırlamak için, aşağıdakileri kaldırmak için VCF dosyasına daha fazla filtre uyguladık: (1) tekrarlayan DNA elemanlarının doğrulandığı veya şüphelenildiği bölgeler; (2) düşük veya yüksek okuma derinliğine sahip bölgeler (havuz-seq verilerine dayanarak); ve (3) ayrı ayrı etiketli izolatların okuma derinliğine dayanarak sorunlu olarak tanımlanan bölgeler (Illumina okumalarının ‘taban çağrısı, genotipleme ve filtreleme’ bölümüne bakın).

Tekrarlayan DNA’yı filtreleme

Kısa okunan verilerle güvenle eşlenemeyen onaylanmış veya şüpheli tekrarlayan DNA (paraloglar dahil) olan bölgelerin çıkarılması, üç tamamlayıcı yaklaşım kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

İlk olarak, referans genomdan maskelenen bölgeleri çıkardık (‘tekrar ek açıklama’ bölümüne bakın).

İkincisi, gizli tekrarlayan DNA içerdiğinden şüphelenilen bölgeleri çıkardık. Referans genomdan (yukarıya bakınız) maskelenmiş bölgeleri çıkarsak da, bir veya bir dizi genom (bizim durumumuzda 18, bkz. ‘Tekrar ek açıklama’ bölümüne bakın), havuz-seq datas kümesinde olduğu gibi daha fazla sayıda izolatta tekrarlayan DNA’da bulunan repertuarın tam kapsamını barındırır. Gizli tekrarlayan DNA, popülasyonlar veya türler arasındaki genetik farklılaşmanın tahminini karıştırabilen sahte heterozigot genotipler üretebilir (örneğin, ref. ¹⁰⁶). Bu nedenle, tekrar kütüphanesini veya filtreleri (örneğin, havuz-seq verileri) oluşturmak için kullanılmayan bir izolattan okumalar kullanılırken, okumalarının bir referans genomuyla benzersiz eşlenmesi, bu okumaların çoğaltılmamış bölgelerden kaynaklandığını doğrulamaz. Gizli tekrarlayan DNA’yı tespit etmek için bir proxy olarak genetik çeşitlilik seviyelerini (π) kullandık. Ortak bir atayı paylaşan tekrarlayan DNA elementleri mutasyonlar biriktirir; Bu nedenle, bu tür lokuslar (iki veya daha fazla kopya) tek bir lokus olarak yanlış bir şekilde birleştirildiğinde, her şeyin eşit kalması koşuluyla daha yüksek seviyelerde genetik çeşitlilik bekler. Bu nedenle, π seviyelerine sahip bölgeleri%1’den fazla çıkardık. Bu eşik, birey havuzları yerine 18 genomda gözlemlenen genetik çeşitlilik seviyesinin hesaplanmasıyla elde edildi (‘Illumina okumalarının analizleri (ayrı ayrı etiketlenmiş izolatlar)’ bölümüne bakın; Ek Tablo 10) Sitelerin sadece% 0.43’ü ve% 1.43’üPD-1 vePD-2 sırasıyla π değerleri%1’den fazla gösterdi. π Site başına, hesaplamalarda eksik verileri dikkate alan ve dolayısıyla tarafsız tahminler sağlayan Pixy (v.1.2.7. beta1) kullanılarak hesaplandı.⁸⁹. Pixy’den site tabanlı hesaplamaların daha sonra, ham sayıları toplayarak ve farklılıkları/karşılaştırma oranlarını ((karşılaştırma oranlarını/karşılaştırma oranlarını yeniden hesaplayarak R (işlev ‘koşucusu ”) ortalaması alındı.https://pixy.readthedocs.io/en/latest/output.html). Havuz-seq verileri için genetik çeşitlilik (‘Q1’ olarak adlandırılır; bkz. Refs. ^107–108) Poolfstat (v.2.0.0) paketindeki ‘Computefst’ işlevi kullanılarak hesaplandı. R’deki genetik çeşitliliğe sahip kayar pencerelerde yer alan siteler% 1’den büyük bir yatak dosyasında saklandı. Bedops (v.2.4.41) tüm ayrık, örtüşen ve bitişik eleman bölgelerini bitişik, ayrık bölgelere düzleştirmek için kullanıldı. Bedtools (v.2.30.0-8) birleştirme, maksimum 500 bp ile ayrılmış özellikleri birleştirmek için kullanıldı.

Üçüncüsü, yukarıda detaylandırılan ikinci filtre ile aynı gerekçeyi kullanarak, ancak farklı bir yaklaşımla, verilerin doğasından yararlandık ( P. yıkımizolatlar haploiddir), haritalamanın bir haploid izolatının analizlerini diploid modunda gerçekleştirirken bir heterozigotun çağrılmasına yol açacağı genomun bölgelerini tanımlamak ve dışlamak için¹⁰⁹. 18 izolatın her biri (ek tabloda listelendiği gibi 10 (dış grup hariç)) referans genomla (Illumina okumaları için ‘veri kontrolü ve eşleme’ bölümüne göre) eşleştirildi ve diploid modunda analiz edildi (yani izolatın diploid olduğu düşünüldüğünde). Bunun için, baz çağrı izolatları ile aynı boru hattını kullandık (GATK ile; ‘Illumina okumalarının analizleri (ayrı ayrı etiketlenmiş izolatlar)’ bölümüne bakın), ancak en az bir izolatta heterozigot olarak puanlanan alanlar bir yatak dosyasına kaydedildi. GD293’ü referans olarak kullanılırken bu 18 genomda toplam 183.756 heterozigot bölgesi (kontiglere yayılmış) tanımlanmıştır. Tüm bu heterozigot bölgeleri, ortaya çıktıkları izolatlara bakılmaksızın, 18 genomun hepsinden çıkarıldı. Her ne kadar bu veriler bunu gösterebilirP.  yıkımdiploid, mikrosatellit analizinin sonuçları bu hipotezi sıkıca reddetti. Gerçekten de, 18 mikrosatellit lokus (bkz. ‘Kültürler ve genotipleme’ bölümüne bakınız) ve 98.622 genotip (5,479 × 18) için tek spordan (yani monosporik izolasyon) kaynaklı 5.479 izolatı genotipledik. Bazı lokuslar için iki alel ve bazı izolatlar beklenirseP. yıkımdiploid idi. Ayrıca, diğer mantar türlerinde diploid modunda haploidler çağırırken bu tür heterozigotluk seviyeleri zaten bildirilmiştir (örneğin, ref. ¹⁰⁹).

Yukarıda detaylandırılan üç tamamlayıcı yaklaşım için oluşturulan yatak dosyaları daha sonra tüm ayrık, örtüşen ve bitişik eleman bölgelerini bitişik, ayrık bölgelere düzleştirmek için Bedops’ta işlenmiştir ve Bedtools birleştirilmiştir. Son yatak dosyasında bulunan bu bölgeler daha sonra Bedtools alt sözleşmesindeki VCF dosyasından hariç tutulmuştur.

Okuma derinliğine göre filtreleme

Birçok mantar türünün aksesuar kromozomları vardır ve ‘taban çağrısı, genotipleme ve filtreleme’ bölümünden elde edilen sonuçlar, bunun her ikisi için de böyle olduğuna dair güçlü kanıtlar sağlar. P. yıkımklape. Sonuç olarak, tek başına okuma derinliğine dayalı sıkı filtreleme mümkün değildi. Bu nedenle, sadece 20 × altında veya havuz başına 600 × üzerinde bir okuma derinliğine sahip siteler ayarlayarak ışık filtreleme gerçekleştirdik. Okuma derinliğine ve ayrı ayrı etiketlenmiş izolatlardan gelen eksik veri seviyelerine dayanarak (Illumina okumaları için ‘veri kontrolü ve eşleme’ bölüm; Ek Tablo 12), havuz-seq verilerinden de filtrelenen birkaç sorunlu contig belirledik.

Filtreleme Sonuçları

Önceki iki bölümde tarif edilen filtreleme aşamaları, her iki klape için her iki klape referans genomuna eşlendiğinde her iki klape için okuma derinliğinin% 95 en yüksek yoğunluklu aralığının (HDI95) daralmasıyla sonuçlandı (Ek Şekil. 6). Referans genom GD45 kullanırken, PD-1 HDI95 5-529’dan 234-560’a düşerken PD-2 HDI95 124-470’den 217-470’e düştü. Referans genomu kullanırken GD293, PD-1 HDI95 92-512’den 236-523’e düşerken PD-2 HDI95 5-511’den 227-542’ye düştü. Filtrelenen pozisyonlar çoğunlukla, sadece olmasa da, 200’den az okuma derinliğine sahip pozisyonlardır (Ek Şek. 6), bu da aksesuar kromozomlarının filtrelenen verilerin önemli bir bölümünü oluşturduğu anlamına gelir. Aksesuar kromozomlarının tekrar zengin olduğu bilindiğinden, bu sonuç bekleniyordu¹¹⁰dolayısıyla çekirdek kromozomlardan daha fazla filtrelenmeleri beklenir. Filtreledikten sonra, veri kümesi 17.110.071 ve 16.733.801 pozisyondan oluşuyordu. PD-1 ve PD-2 havuzlar sırasıyla GD293 ve 16.675.338 ve 17.286.690 pozisyonu PD-1 ve PD-2 havuzlar sırasıyla GD45’e eşlenmiştir. Medyan okuma derinlikleri 446 ve 382 idi. PD-1 ve PDSırasıyla -2, GD45 ile eşlenmiştir. Medyan okuma derinlikleri 425 ve 437 idi PD -1 ve PD Sırasıyla -2, GD293 ile haritalanmıştır. GD293 ve GD45 üzerindeki havuzları haritalarken benzer sayıda SNP (55,919 ve 57.330) tanımlanmıştır.

Farklılaşma endeksinin hesaplanması F
_ST

VCF dosyası daha sonra Poolfstat (v.2.0.0) kullanılarak R’ye aktarıldı.¹⁰⁸ ve vcf2pooldata işlevi (havuz boyutunu klape için 69 ve 63 olarak belirler PD -1 ve PD -2, sırasıyla, max.cov.per.pool = 600, min.cov.per.pool = 20). Çok odaklı F_ST Daha sonra Compute.fst işlevi ile 200 SNP’de hesaplandı.

Büyüme oranlarında ve büyüme-orta renkte varyasyonlar

Kültürle ilişkili özelliklerdeki varyasyonları değerlendirmek için, aynı kamera, lens ve ayarlar kullanılarak özel olarak inşa edilmiş bir fotobokta bir izolat alt kümesi fotoğraflandı (60 mm Canon Makro lens EF-S, Canon EOS 600D, açıklık = 3.2, ISO = 400, değerlendirme Metering; Bkz. Ref. ¹¹¹), 8 hafta boyunca iki haftada bir. Bu amaçla, 45 ve 34 izolat PD -1 ve PD-2, sırasıyla aynı gün aynı kültür ortamında yeniden kültürlendi. Altı gün sonra, her izolat için, tek bir çimlenme sporu fiziksel olarak büyüme ortamı olan yeni bir plakaya (‘kültürler ve genotipleme’ detaylandırılmıştır) taşındı ve 10 ° C’de baş aşağı saklandı. İzolatların kimliği ek tabloda verilmiştir 1.

Büyüme Analizi

Resimlerin analizi R (V.4.1.1) ‘de gerçekleştirildi.⁵² EBIMAGE paketlerini kullanarak (v.4.3)¹¹²KS (V.1.14.1)¹¹³Adehabitathr (v.0.4.21)^114–115SP (V.1.4-6)¹¹⁶ ve adimpro (v.0.9.6)¹¹⁷. Görüntüler, kırmızı, yeşil ve mavi kanalların her pikselinin yoğunluğunu çıkaran ReadImage işlevi kullanılarak R’ye aktarıldı. Kırmızı yoğunluklu pikseller 0.7’nin üzerindeki pikseller kültürlerin karakteristiği iken, arka plan (kültür ortamı) 0.7’nin altındaydı. Kırmızı yoğunluğa sahip piksellerin koordinatları (yani, görüntüdeki konumları) 0.7’nin üzerinde depolandı ve Adehabitathr paketinin MCP fonksiyonunu kullanarak minimum dışbükey çokgen (MCP) hesaplamak için kullanıldı. MCP, mantar büyümesinin kenarını özetlemek ve kapsadığı piksel sayısını hesaplamak için kullanıldı. % 100 MCP’ye dahil edilecek ve bu nedenle kültür büyüklüğünü yapay olarak artıracak olan plaka üzerinde bulunan (örneğin, su veya kir damlacıkları) karanlık manevi olmayan malzeme ile potansiyel sorunların üstesinden gelmek için, 1 (11 değerler; yani, MCP 85’e kadar% 95’e kadar) aykırı değerler hariç, izolat başına 11 mcps hesapladık. Daha sonra mantarın kapsadığı piksel sayısını tahmin ettik (örneğin, MCP%90 ile hesaplanan 180 piksel kapsayan bir izolat için: 180/90 × 100 = 200 piksel). Her MCP için, pikseller nihayet bilinen boyutta bir nesneye göre çapraz çarpma kullanılarak santimetre kareye dönüştürüldü (5.207681 cm²). Her bir izolat için, 11 MCP’deki ortalama kullanıldı ve tahminlerin kalitesi, 11 MCP için yapılan tahminin standart sapması ve orijinal resmin üstünde tasvir edilen MCP’lerin kenarının görsel incelemesi kullanılarak değerlendirildi. Ortaya çıkan kültür boyutları genişletilmiş verilerde görselleştirilmiştir. 4 ve ek masa 9.

Kültür karanlığının analizi

Kültür büyümesinin bir sonucu olarak kültür ortamının renklendirilmesi, büyüme analizi için alınan aynı resimlerden ölçüldü (bkz. ‘Büyüme Analizi’ bölümüne bakın; PD -1 ve 34 izolatlar PD -2). Analizler EBIMAGE (V.4.3) kullanılarak R’de gerçekleştirildi¹¹². Renkli görüntüler siyah beyaz görüntülere dönüştürüldü ve piksel yoğunluğu (0 ila 1; 1 beyaz ve 0 siyah olması), kültür ortamını gösteren (yani kültürün kenarına dokunmamak ve aynı zamanda mantar büyümesi ile önlenmeyen) 3 dikdörtgende kaydedildi. Üç dikdörtgen arasındaki medyan piksel yoğunluğu, kültür karanlığı için bir proxy olarak kullanıldı. Her izolat için, 1 hafta sonra çekilen ve 8 hafta sonra alınan resim arasındaki piksel yoğunluğu farkı hesaplandı (8 hafta – 1 hafta, karanlık arttığında pozitif bir değere neden, karanlık azaldığında negatif bir değer). Sonuçlar genişletilmiş verilerde sunulmuştur. 2 ve ek masa 8.

Haritalar ve çizim

Aksi belirtilmedikçe, şekiller R’de taban R’den fonksiyonlar kullanılarak üretildi⁵² ve ggplot2 (v.3.5.0)¹¹⁸. Haritalar (Şek. 1A Ve 2a) Stadia haritalarından fayans olarak indirildi (https://stadiamaps.com/) OpenstreetMap tarafından verilerle (ODBL altında, Stamen Design tarafından harita karoları CC 4.0) ve GGMAP paketi kullanılarak çizildi (v.3.0.2)¹¹⁹. Doğal bitki örtüsü renklerini ve yüksekliği (gölgelendirme yoluyla) temsil eden renklerle ‘Stamen_terrain_background’ tiplerini temsil ederler. Şek. 3a Ve 4a, b R paketleri Rworldmap’ten elde edildi (v.1.3.8)¹²⁰ ve rworldxtra (v.1.0.1)¹²¹. Yarasa türleri dağılımı Uluslararası Doğanın Koruma Birliği (IUCN) web sitesinden kurtarıldı¹²² şekil dosyaları olarak (https://www.iucnredlist.org/) ve R. Inkscape¹²³ (V1.1.1; https://inkscape.org) görselleştirmeleri optimize etmek için kullanıldı.

İstatistiksel analizler

Clade kimliği arasındaki ilişkiyi test ettik (PD -1 veya PD-2; ikili yanıt) ve BAT türleri (nominal değişken), enlem ve boylam dahil çevresel faktörler (her iki sayısal değişken de ölçeklendirildi). Bu analiz için hazırda bekletme sırasında tanımlanması zor olan yakından ilişkili yarasa türleri birlikte toplandı. Ayrıca, model yakınsamasını artırmak ve modelin tanımlanabilirliğini sağlamak için, sadece en sık enfekte olmuş türler, yani izole ettiğimiz türler PDModele on veya daha fazla alan dahil edildi. Bu, Avrupa’daki 231 bölgeden 4,295 izolat içeren bir veri kümesiyle sonuçlandı: aşağıdaki gibi parçalandı: M. Mystacinus(28 izolat, 10 site); M. dasyceme(107 izolat, 11 site); M. Daubenoniii (111 izolat, 17 site); Miyotistür kompleksi (322 izolat, 38 saha); Ve M. miyotis/Blythii (3.727 izolat, 187 site). Yanıt değişkenimiz ve bir logit bağlantısı işlevi olarak klan kimliğini kullanarak Bayes hiyerarşik bir modele uyuyoruz. Yarasa türleri, enlem ve boylam, popülasyon düzeyinde etkiler (frekanslı bir yaklaşımda sabit bir etkiye benzer) olarak dahil edilirken, numuneler (bölgelerde yuvalanmış) ve bölgeler, rastgele kesişme ile grup etkisi (frekanslı bir yaklaşımda rastgele bir etkiye benzer) olarak dahil edildi. Grup düzeyinde etkiler, siteler arasındaki ve Withinite numuneleri arasındaki farklılıkları hesaba katmak için kullanıldı. Her ikisi de göz önüne alındığında P. yıkım Kabaklar kabaca eşit sayıda bulundu M. Mystacinus (13 ve 15 izolat PD-1 ve PDSırasıyla -2), bu yarasa türü taban çizgisi kategorisi olarak kullanılmıştır. Model parametrelerini tahmin etmek ve Bayesian çıkarımını gerçekleştirmek için model, her biri 10.000 yinelemeli 8 zincir kullanılarak takıldı. Yakınsamayı artırmak için, algoritmanın kabul oranını kontrol eden ‘ADAPT_DELTA’ parametresi 0.99 olarak ayarlandı. Her zincirin ilk 1.000 yinelemesi yakınsama sağlamak için ısınma (yanma) olarak atıldı. Zincirler, STAN’daki Fındık (U-Turn örnekleyici olmayan) algoritması kullanılarak örneklendi (https://mc-stan.org/) brms ile (v. 2.20.3)¹²⁴ R.’deki paket. Çizimlerin kalitesini değerlendirmek için etkili örnek büyüklüğü ölçümleri (Bulk_ess ve Tail_ess) hesaplandı ve daha önce önerilen zincirlerin yakınsamasını değerlendirmek için potansiyel ölçek azaltma faktörü (RHAT) kullanıldı¹²⁵. Açıklayıcı değişkenler arasındaki ortaklık, ‘performansta’ bulunan ‘CHECK_COLLINEARity’ fonksiyonu ile hesaplanan genelleştirilmiş varyans enflasyon faktörü kullanılarak değerlendirildi (v.0.12.4)¹²⁶ R.

Barkodlama genlerinin analizleri

Tek kopya genleri olan iki evrensel barkodlama geni, çeviri uzama faktörü 1a (TEF1 ) ve DNA’ya yönelik RNA polimeraz II alt birimi B (RPB2)¹²⁷ (RPB2). Bu iki genin sekanslarını 18 izolatın tam genomlarından (referans genom GD293’te haritalanmış okuduğuna dayanarak, ‘Illumina okumalarının analizleri (ayrı ayrı etiketlenmiş izolatlar)’ bölümüne bakın) ve her birinin filtrelenmiş havuz-seq veri kümelerinden bkz. P. yıkım Clade, PD-1 ve PDSırasıyla 69 ve 63 izolat içeren -2 (ayrıca GD293’te haritalanmış; Bu, ayırt edebilecek sabit pozisyonları aramak için yapıldı. P. yıkımklape.

150 izolattan (havuz-seq verilerinden 69 ve 63; tam genomlardan 18) dizilere dayanarak, TEF1(GD293 Contig 34’te 3155612, 3155783, 315783, 3157304, 3157304, 3157318 ve 3157602 pozisyonlarında) ve üç RPB2(GD293’ün Contig 34’ünde 523497, 525708 ve 526300 pozisyonlarında) PD-1 ve PD-2 klape. Bu dokuz ikame klapelerde sabitlendi. Yukarıda belirtilen 18 izolattan ve GD267 dış grubundan gelen sekanslara dayanarak, her iki klape her bir gen için ayrı ayrı bir filogenetik ağaç inşa ederken monofilik gruplar oluşturdu (veriler gösterilmemiştir).

Bu ayrımcı sitelere dayanarak TEF1Ve RPB2NCBI’da yayınlanmış nükleotit sekanslarında arama yaptık. P. yıkımİzolatları her iki klana sınıflandırmak için PD-1 veya PD-2. Bu yaklaşımı kullanarak, Çek Cumhuriyeti’nden bir dizi izolat (N= 3), Portekiz (N= 13) ve Güney Kore (N= 2) klana ait olarak tanımlanabilir PD-2 (Ek Tablo 14), Örneğin. Bu veriler, ana metinde sunulan verilerle birleştiğinde, PD-1 ve PD-2 Avrupa’da ortaklaşa, ancak şimdiye kadar sadece PD-2 Doğu Asya’da bulundu (biri Çin’den biri Moğolistan’dan, ikisi Güney Kore’den). Bu sonuç bunu PD-1 Doğu Asya’da daha nadirdir, hatta belki de yoktur.

Raporlama Özeti

Araştırma tasarımı hakkında daha fazla bilgi,Doğa portföyü raporlama özeti Bu makaleye bağlı.